高速逆流色谱制备分离纯化来自中药菝葜的抗炎有效组分三种黄酮类化合物外文翻译资料

 2022-04-14 21:03:19

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高速逆流色谱制备分离纯化来自中药菝葜的抗炎有效组分三种黄酮类化合物

摘要：黄酮类是Sm china L.的主要化学成分并被认为是Smilax china L.负责消炎的活性成分。在这项研究中，一个合适的HSCCC方法被开发用于一步分离在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:10:1:10，v/ v/v/v）组成的两相溶胶系统中三种主要抗慢性盆腔炎症（CPID）的黄酮类化合物。从200毫克的菝葜抗CPID有效成分将42毫克落新毒素，10毫克新异烟酰胺和6毫克槲皮素-3-O-alpha;-L-鼠李糖苷分离，通过HPLC分析纯度分别为98.3％，98.7％，98.5％。正交试验L9（34）也用于研究三种类黄酮的最佳提取条件。HSCCC被成功用于分离和纯化来自菝葜抗CPID有效部分三种类黄酮并且新异烟酰胺是首次从菝葜中分离出来。

关键词：落新毒素;高速逆流色谱;新异烟酰胺;槲皮素-3-O-alpha;-L-鼠李糖苷;菝葜

介绍：菝葜在中国被广泛称为“金刚藤“，属于百合科。它是一般用于中医药和记录在中国药典[1]具有抗炎作用[2-4]，抗氧化剂[5-7]和抗癌剂[8-10]。在中国，菝葜已广泛用于慢性盆腔炎性疾病（CPID）。到目前为止，植物化学研究已经显示从菝葜中分离出来的一些黄酮类，甾体皂苷和其他多卟啉中黄酮类被认为是主要的生物活性物质并且表现出生物学特性如抗炎[2,11]抗肿瘤[12]等等。特别是从菝葜的乙酸乙酯组分分离出的落新毒素对抗炎症[13]，创面愈合[14]和抗氧化[15，16]，并在中国药典中被选定为菝葜标记化合物。

鉴于上述显着的生物活性，开发选择性分离纯化方法以从菝葜获得大量的纯黄酮是至关重要的。因为它们的结构相似性、不稳定的化学性质、不可逆的吸附和费时很难通过常规柱色谱分离方法获得高纯度的化合物。高速逆流色谱法（HSCCC）是一种无载体的液-液分离色谱技术，消除了样品在固体支持物上不可逆吸附的缺点并具有良好的样品回收率[17]。作为先进的分离技术，近年来HSCCC已被广泛应用于从传统中药和其他天然产物中分离和纯化功能成分[18-20]。

我们以前的药理学研究已经证明，菝葜中的乙酸乙酯提取物对CPID有显著影响[21]。现在以生物活性为指导，采用高效的HSCCC方法制备分离和纯三个主要的黄酮类化合物，来自菝葜的三种有效成分落新毒素，新异甾醇和槲皮素-3-O-alpha;-L-鼠李糖（图1）已经确定。此外，还通过正交试验L9（34）研究了这三种类黄酮的最佳提取条件。从菝葜中得到的纯化的黄酮可以是用于质量控制和进一步的药理学研究。据我们所知，没有报道已经发表了关于这些的由HSCCC分离和纯化菝葜有效部位的三种黄酮类化合物。

图1.三种黄酮类物质的化学结构

实验

试剂和材料

所有用于制备粗制样品和HSCCC的有机溶剂包括正己烷，甲醇，乙酸乙酯等都是分析级（中国天津大茂化工厂）。用于HPLC法的乙腈是分析级的（Oceanpak Alexative Chemical Reagent Corporation，瑞典）。用于HPLC分析的超纯水由Q Milipore System（Millipore，USA）提供。干燥的菝葜药材是由南方医院采购部购买的来自中国湖南的草药市场的菝葜。被康鹏博士（中国中医科学院中药研究所，南方医科大学，中国）确定并通过南方医科大学天然药物系（参考文献）中的凭证标本第201206201号）认证。

仪器

在本研究中使用的高速逆流色谱仪是TBE-300B型（上海Tauto Biotech公司，中国）。该装置由串联连接的三个制备线圈（聚四氟乙烯（PTFE）管的直径= 3.0mm;总体积=300毫升）和20毫升样品环组成。仪器的变速在速度控制器的调节范围内0-1000转/分钟。 HSCCC系统配备了一个TBP-5002恒流泵（上海陶都生物公司，中国），一种UV检测器（型号UV-TBD2000），其具有六种检测波长：214,254,280,313,365，和405 nm（上海陶都生物公司，中国），一台SHP DC0506恒温循环仪（中国上海顺义恒平公司）和一个HW2000型工作站（浙江大学，杭州，中国）。HPLC分析在Shimadzu LC-20A上进行（日本岛津）配备SPD-20A检测器，一台LC-20AD泵，一台SIL-20A自动进样器，一台DGU-20A脱气机和Shimadzu HPLC工作站。这里使用的核磁共振（NMR）光谱仪是Bruker-400核磁共振波谱仪（Bruker，瑞士）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）操作Waters ZQ4000（Waters，USA）。

粗制样品的制备

通过正交试验对菝葜的三种黄酮类化合物的提取条件研究进行了优化。根据实验，菝葜干燥的根茎（5kg）切碎并用9L 90％乙醇分别回流两次，2小时。该萃取液合并，并在60℃蒸发溶剂。

在减压下使用旋转蒸发回收乙醇。然后将萃取液减压过滤，滤液连续在乙酸乙酯和正丁醇的分液漏斗中分配。获得乙酸乙酯组分，正丁醇组分和水组分。每个组分在60℃使用旋转蒸发减压蒸发。每个组分的在诱导CPID大鼠上对抗慢性盆腔炎疾病（CPID）活性的进行了评估。结果表明乙酸乙酯部分对CPID有显着影响。所以乙酸乙酯组分通过聚酰胺树脂柱进一步纯化，依次用蒸馏水，10％乙醇和50％乙醇洗脱。在50％乙醇组分减压蒸发并干燥成粉末。然后50％乙醇

也在诱导的CPID大鼠中评估。结果表明它对CPID也有重要影响。将50％乙醇组分通过硅胶柱分馏，用石油醚-乙酸乙酯混合物（1：3,1：1：5,1：6，v/v）。获得组分（1：3，v/v）并用作粗样品用于随后的分离和高速逆流色谱分离。

分配系数（K）的测量

许多两相溶剂体系经过测试根据目标化合物分配系数（K）的值改变单独溶剂的比例以获得最佳组成。目标化合物的K值通过HPLC分析测定如下：将称量的2mg粗样品加到10mL试管中，通过2mL预平衡的两相溶剂系统。然后塞住试管并剧烈摇动5分钟以使样品在两个系统之间彻底平衡。将上部和下部的等量（100mu;L）液体分别蒸发至干燥。残渣用甲醇稀释至1ml并通过HPLC确定各目标组分的K值。K值被定义为在上/下相存在的化合物的峰面积比率。

制备的两相溶剂系统和样品的溶液

在目前的研究中，HSCCC分离的两相溶剂系统组成为n-正己烷，乙酸乙酯，甲醇，和水的体积比为1：10：1：10（v / v / v / v）。在室温下通过反复摇晃在分液漏斗每个溶剂的混合物被彻底平衡。使用前这两相溶剂被分离和脱气20分钟。在HSCCC试验中采用头部到尾洗脱模式与上相作为固定相，而下相是用作流动相。样品溶液的配制是通过将粗样品溶解在于开发溶剂相同组成的等体积的上相和下相组成的溶液中。

HSCCC分离过程

在HSCCC分离过程中，多层螺旋型柱首先被上相溶剂填满。然后设备以850rpm旋转，而下相由泵在流速1.5 ml /分钟以头到尾洗脱模型。分离温度被设置在25◦C。由流动相在尾部出口清晰流出表示柱的平衡建立后，含有200毫克粗样品的15 ml样品溶液通过喷射阀被注入。uv探测器在280 nm处连续监测流出液。根据色谱峰型上显示的记录组分被手动收集。分离完成后，用加压空气将固定相泵出柱并用量筒收集以测量保留体积。

高效液相色谱分析和鉴定HSCCC峰组分

乙醇提取组分，乙酸乙酯组分，粗样品组分通过聚酰胺树脂柱纯化和纯化的组分用HSCCC分离并且高效液相色谱法分析lc-20a与列（hypersil c18柱250毫米times;4.6毫米，i.d. 5mu;m）在室温温度，乙腈和水组成的流动相，以流速0.7 ml /分钟流动。由uv探测器在290 nm处监测流出液。样品和流动相通过0.22mu;m过滤器进行过滤，在高效液相色谱法之前注射。分离组分的纯度值计算由面积归一法。HSCCC组分特性由ESI-ms，核磁共振，和碳13-核磁共振光谱分析，二甲基亚砜（二甲亚砜）作为溶剂和TMS（三甲基硅烷）作为内标物质。

结果和讨论

优化合适的高效液相色谱条件

粗提取物和HSCCC分离组分都进行了分析高效液相色谱法，从而合适的高效液相色谱条件是必要的。在本文，不同的流动相，不同洗脱模式，和不同的流率均进行了测试。结果表明，再hypersil c18柱（250毫米times;4.6毫米，5mu;m）取得良好的分离时，使用的流动相组成的水（溶液A，0.04％磷酸）和乙腈（溶剂B）在梯度模式如下：0.0分（12％b）-15.0分钟（13％b）-85.0分钟（21％b）-85.01分钟（95％b）- 115.0分钟（95％b）。分析程序被检测通过波长290 nm的uv探测器，而流率0.7 ml /分钟。这三个目标黄酮类化合物可以获得良好的分离。

制备的粗样品

正交l9（34）测试设计是适用于选择从菝葜属提取三个黄酮类化合物最佳参数的的组合四个因素（乙醇浓度，固体：液体的比例，提取时间，和重复提取次数）。在此基础上，这些实验结果ments（表1），最佳提取条件90％的乙醇浓度，1：9比固体：液体，2 h的萃取化时间，和2提取物。三种化合物在不同的提取方法含量测定根据三个黄酮类化合物的校准化曲线。astilbin的分析曲线的是c（mu;g）= 4659806a 268049，和它的线性度是在质量范围1.2到8.0mu;g的相关系数的0.9999。neoisoastilbin的分析曲线是c（mu;g）= 3376709a 221429，和它的线性度是在质量范围1.2到8.0mu;g的相关系数的0.9999。槲皮素-3-o-alpha;-l鼠李糖苷的分析曲线是c（mu;g）= 1232989a 130817，和它的线性度是在质量范围1.3到8.4mu;g的相关系数的0.9999。c是确定的三个黄酮类化合物的质量和A是峰面积。5公斤菝葜属取得了1公斤乙醇提取物和astilbin，neoisoastilbin，和槲皮素3-邻alpha;-l鼠李糖苷在乙醇提取物的含量分别为（图2a的）0.07％，0.03％，0.04％。然后用乙酸乙酯萃取（图2b的），150 g的乙酸乙酯提取物分别获得astilbin，neoisoastilbin，和槲皮素3-邻alpha;-l鼠李糖苷含量是3.29％，0.91％，和1.84％。然后，乙酸乙酯分数是纯化的聚酰胺树脂（图2c型）。90 g的粗提取物得到astilbin，neoisoastilbin，和槲皮素3-邻alpha;-l鼠李糖苷含量分别是6.82％，3.24％，和2.36％，恢复率分别是98.6，99.4％，和98.1％。结果表明，该从有菝葜有效组分分离的三种目标黄酮类化合物可以富集通过聚酰胺树脂并且适用于HSCCC分离。

表1、CPID大鼠中50％乙醇部分样品的抗CPID效应

选择适合的两相系统以及其他的HSCCC条件

HSCCC的成功分离在很大程度上取决于选择合适的两相溶剂体系，这对于目标化合物（22）而言是理想的分离率。该目标化合物的最合适的K值通常在0.5-2.0的范围内。如果K值太小，那么溶质将在溶剂前沿附近彼此靠近洗脱，这可能导致峰值分辨率的损失，而较高的K值往往会有一个好的分离，但它会造成峰变宽和长时间的洗脱时间。

在目前的研究中，考虑到黄酮类特性和以前的HSCCC研究，设计一系列通用的由正己烷，乙酸乙酯，甲醇，通过改变体积比例来实现目标化合物的高效分离。在六种不同体积比和溶液系统的K值测量并总结表2。所有选定的两相溶剂体系均可形成两个相与可改变的体积比率，以避免浪费和时间小于15秒。

表2.目标化合物的最合适的K值

从表2可以看出使用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水（1:1:1:1,1:3:1:3，v / v / v / v）作为两相溶剂体系，K值很小这可能会导致分离效果较差。目标黄酮类化合物被迅速从柱子上洗脱下来，不能被分离。当使用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水（1:15:1:15，v / v / v / v）作为两相溶剂体系槲皮素-3-O-alpha;-L-鼠李糖苷的K值过大将会在宽峰中被长时间洗脱。当正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水（1:5:1:5，1：7：1：7，v / v / v / v）作为两相溶剂系统，他们有可改变的K值，但是astilbin和neoisoastilbin不能很好地分离。当正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水（1:10:1:10，v / v / v / v）时，用作两相溶剂体系，三种类黄酮具有大K值虽然不在K=0.5-2.0的最佳范围内，但分离效果很好。因此，HSCCC分离的溶剂系统由正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水组成选择1:10:1:10的体积比作为两相溶剂。上相被使用作为固定相，下相作为流动相。

本文研究对流动相流速的影响和转速也进行了调查。结果表明在一定程度上减少流速可以提高分离效果，但是需要更多的时间和更多流动相。因此，经过几次实验后用于HSCCC选择的流动相流速为1.5mL /分钟。盘管的旋转速度对固定相的保留分数的有影响。我们的实验表明高转速可能会在一定程度上增加固定的保留。但高转速会降低仪器的寿命。在这个实验中，所有的分离在850rpm的转速下进行。

HSCCC分离黄酮类化合物

根据上述两相溶液系统的优化条件和基于制备HSCCC的洗脱曲线（图3），所有收集的部分根据它们的类似概况进行汇集。然后将它们冻干。 从200mg粗样品中获得10mg峰I，42mg峰II和6mg峰III。并且他们的HPLC色谱

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