番泻苷A,提取自传统中草药大黄,是一种新的关于HIV-1复制的双重抑制剂外文翻译资料

 2022-04-30 22:10:47

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番泻苷A,提取自传统中草药大黄,是一种新的关于HIV-1复制的双重抑制剂

摘要

背景:尽管提供了有效的抗逆转录病毒疗法,但仍需要采用新的行动模式的HIV-1治疗药物。这种新的方法旨在不仅识别HIV-1双重抑制剂,还可同时抑制两种病毒功能小分子。大黄,来源于掌叶大黄和药用大黄,在中医实践中是最早和最常用的药用植物之一。我们想通过探索中医来鉴别新的具有抗HIV-1双重作用能力的化学支架。

方法:采用HIV-1逆转录酶(RT)相关DNA多聚酶链反应(RDDP)和核糖核酸酶H(RNase H)活性测定方法,对掌叶大黄和药用大黄提取物及其主要分离成分蒽醌衍生物进行了生化测定。然后测定活性化合物对HIV-1突变的RTS、整合酶(IN)和病毒复制的影响。

结果:掌叶大黄和药用大黄两种提取物均能抑制HIV-1 RT相关的RNase H活性,在分离的组分中,番泻叶苷A和B对RDDP和RNase H RT相关功能在生化检测中均有效。在K103N、Y181C、Y188L、N474A和Q475A突变的RTS上,番泻苷 A的活性较弱,提示其抗病毒活性与两个RT结合位点有关。番泻叶苷A还影响HIV-1在体外的活性和HIV-1复制在细胞基础上的检测。病毒DNA的产生和添加时间的研究表明,番泻叶苷A主要作用于HIV-1的逆转录过程。

结论:番泻苷A是一种新的HIV-1双RT抑制剂的支架材料。

引言

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的逆转录酶(RT)负责病毒基因组的逆转录过程,这是HIV-1复制周期中的一个基本步骤,也是鉴定新的抗逆转录病毒抑制剂的一个仍有吸引力的靶点(Esposito等人,2012年a;Corona等人,2013;Divito等人,2013;Esposito和Tramontano,2013)。HIV-1 RT是一种多功能蛋白质,具有两种主要的酶功能:RNA-依赖性DNA聚合酶(RDDP)活性,其涉及RNA:DNA中间体的形成;核糖核酸酶H(RNase H)活性,涉及RNA:DNA杂交体的RNA链的水解切割(Esposito等,2012b)。目前,世界上3000万以上的HIV-1感染者没有疫苗,但已经开发出一种有效的抗逆转录病毒疗法,称为高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)。HAART一线治疗通常由两个核苷RT抑制剂(NRTI)组成,其中加入了非核苷RT抑制剂(NNRTIs)或蛋白酶抑制剂(PI)。HIV-1 IN抑制剂(INIs)有望保留对其他抗逆转录病毒药物耐药的HIV-1株的疗效,是一种有效的二线疗法。急性和慢性药物毒性和耐药菌株的选择,特别是对RTIs的耐药,是确定新的抗病毒药物的有效理由。事实上,具有新的作用方式的药物的开发,例如可能作用于两种不同目标酶或两种不同催化功能的单分子,将减少所使用药物的数量、慢性毒性以及选择耐药病毒的机会(Diffinto等, 2013; Esposito and Tramontano, 2013 )。

在过去的20年中,一些研究工作集中在利用天然产物作为支架来开发潜在的抗病毒药物(Li和Vederas,2009;Cos等人,2008; Yu等人,2007; Bicchi等人,2009; Xu等人),虽然目前还没有能够阻止HIV-1复制的天然化合物进入临床试验。在中国,中草药是主要的古代治疗系统,其成分是最重要的。大黄,通常来源于掌叶大黄和药用大黄,是中药材中最早也是最常用的药用植物之一(北京:中国医药科技出版社,2010)。

大黄使用最早的记录来源于东汉的神农本草(公元102-200年),其中记载大黄用于治疗便秘和痢疾。在现代研究的基础上,大黄的新应用涉及到治疗慢性肾功能衰竭、保护受损肝和抗衰老作用(Xu等人,2015;Lu等人,2014;Xie和Sang,2014)。大黄(蓼科) 在世界上分布着有60多种类型,在中国西部和北部地区就有39种,它是我国最重要的药用资源之一,也是天然蒽醌类化合物的主要植物来源之一(Xiao等,1980)。据报道在大黄中存在的蒽醌类化合物(Ye等人,2007),番泻叶皂甙(番泻苷 A和番泻苷 B)被认为是具有抗肿瘤和抗炎作用的成分(Xiao等人,1980;Zwing,1972),大黄酸和雷公藤具有抗肿瘤和抗炎作用(Zwing,1972;He等人,2011),后者还具有肝保护、抗真菌和抗癌活性(He等人,2011)。芦荟大黄素、大黄素和大黄酚可降低血清总胆红素水平,对胆汁淤积性肝损伤有部分保护作用(Zhao等人,2009)。没食子酸葡萄糖酯(Maldonado等人,2011)、萘(Tsuboi等人,1977)和儿茶素(Sill等人,1974)具有潜在的抗氧化和抗癌作用。据报道,许多多酚衍生物,例如蒽醌类化合物,都会干扰不同病毒的生命周期,其中包括:小鼠脑心肌炎病毒(Barnard等人,1992)、人巨细胞病毒(Barnard等人,1992;Bamard等人,1995)、脊髓灰质炎病毒(Semple等人,2011)和乙型肝炎病毒(Dang等人,2006),以及抑制HCV NS5B聚合酶(Tramontano等人,2011)和HIV-1 RT(Tramontano等人,2011;Higuchi等人,1991;Esposito等人,2012a,2011;Kharlamova等人,2009) 的催化活性和整合酶(IN)在生化检测中的作用(Tintori等人,2015;Esposito等人,2015)。特别是,许多蒽醌衍生物被报道出在生化检测中都会影响HIV-1 RDDP和RNase H RT相关功能,但不活跃于基于细胞的病毒复制(Tramontano等人,2011;Higuchi等人,1991;Esposito等人,2012年b,2011;Kharlamova等人,2009)。因此,我们需要评估大黄化学成分对HIV-1 的相关RT和IN活性的抑制作用,以及干扰HIV-1生命周期的作用,以确定抑制多种HIV-1靶点的新支架。

材料与方法

植物材料和试剂

2007.06-2007.09间,其中一位作者分别从甘肃和四川采集了掌叶大黄及药用大黄,并在室温下自然干燥。原料经中国北京药用植物发展研究所李安仁教授认证。凭单样本存放在中国北京药厂发展研究所药典实验室。参考化合物芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素是从国家药品和生物制品控制研究所(北京,中国)购买的,番泻苷A和番泻苷B是从曼西特制药有限公司购买的(中国成都)。阳性控制(S)-6-氯-4-(环丙基炔基)- 4 -(三氟甲基)-1H苯并[D] [1,3]恶嗪-2(4H)-1(依法韦仑)购自Sigma奥德里奇(米兰,意大利),(Z)-乙基-4-(1-(2-氯苄基)-1H-吡咯-3-基)-2-羟基-4-氧代丁-2-烯酸(RDS1759)由DiSanto教授(罗马拉萨皮恩扎大学)供,N-[(4-氟苯) 甲基]-1,6-二氢-5-羟基-1-甲基-2-[1-甲基-1-[[(5-甲基-1,3,4-恶二唑-2-基) 羰基] 氨基] 乙基]-6-氧-4-嘧啶甲酰胺一钾盐(雷特格韦) 是从ChemScene 购买的(Monmouth Junction, NJ),HPLC级乙腈和甲醇购自Burdik&Jackson(美国密歇根州Muskegon市)。采用Milli-Q体系制备了去离子水。磷酸、甲醇均为北京北海精细化工有限公司采购的分析级产品(中国北京)。

样品溶液的制备

用电磨机将干燥的植物根部磨成粉末(40目)。每样(sim;200 mg)准确称重,然后与30 ml甲醇/水(30 ml,80:20,v/v)混合,室温下超声处理60 min。提取液冷却至室温,在原重量中加入适量溶液,经0.22um膜过滤,每次注射10ul。(图S1)。

用150 ml甲醇/水(80:20,v/v)提取掌叶大黄根和药用大黄根(sim;1g),每次浸提60 min,提取2次。提取液浓缩并冷冻干燥,约113毫克的能量收获。

蛋白质表达与纯化

亚克隆入p6HRT_prot质粒的HIV-1RT基因由Stuart Le Grice提供(NCI,弗雷德里克,马里兰州,美国)。蛋白在M15 Es-cherichia coli细胞中进行表达和纯化(Esposito等人,2012 a)。全长IN和LEDGF蛋白在BL21大肠杆菌(DE3)中表达(Tintori等人,2015;Esposito等人,2015)。HIV-1 K103N、Y108C和Y188L RT突变体是根据制造商的说明使用Stratagene试剂盒(意大利米兰诺,Agilent Technologies)通过现场定向诱变产生的(Corona等人,2014年a)。

RNase H聚合酶-不依赖切割试验

检测HIV-1RT相关的RNase H活性,如前人所述(Esposito等人,2013)。

RDDP法

使用Enz-Check反向转录酶试剂盒(生命技术,Carlsbad,美国加利福尼亚州)测量与HIV-1 RT相关的RDDP活性,如前所述(corona等人,2014a.)。Yonetani-Theorell分析按先前的报道进行(esposito等人,2011)。

均相时间分辨荧光(HTRF)LEDGF依赖与独立检测

在LEDGF / p75依赖性测定中,允许在重组的LEDGF/p75蛋白的存在下测量在反应中3rsquo;的处理和链转移的抑制,如前所述(Tintori等人,2015;Esposito等人,2015)。

细胞系培养

从ATCC(Manassas,VA,USA)获得人T淋巴母细胞Jurkat细胞系,克隆E6-1和人胚肾293T细胞系并保持在RPMI 1640或DMEM(GIBCO,Life Technologies,Monza,Italy),分别在37℃,5%CO2湿润气氛下补充10%热灭活的胎牛血清。

质粒和病毒

通过如先前所述(Cullen,1987)通过DEAE-葡聚糖方法用含有HIV-1感染性HXBc2分子克隆的pSVC21质粒(Ratner等,1985)瞬时转染Jurkat细胞产生HIV-1原种并储存在-80℃直到使用。 通过Reed和Muench终点稀释法(Reed和Muench,1938)在C8166细胞上测量病毒滴度为50%组织培养感染剂量(TCID50)/ml。

用Ca3(PO4)2法将293T细胞与pSVC21 Vpr Vpu Nef Delta;env-CAT质粒和pSVIIIenv质粒(J.Sodroski,Harvard University,Boston)共转染获得重组HIV-1 HXBc2型CAT病毒。pSVC2.1 Vpr Vpr Nef Delta;env Cat质粒(sartori等人,2011)来自pSVC2.1质粒(J.sodroski,哈佛大学,波士顿),该质粒包含HIV-1 HXBc 2的前基因组(vif -vpu-vpr-nef-),方法是插入vpu、vpr和nef编码序列并删除BgIII-BgIII env区域。将氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因插入pSVC2.1 Vpr Vpu Nef Delta;env载体,使rev基因失活。pSVIIIenv质粒与Rev一起表达HIV-1实验室适形T细胞嗜性株HXBc2包膜糖蛋白。转染48h后收集表达CAT的重组HIV-1病毒,过滤(0.45um孔径滤膜)。根据逆转录酶(RT)活性测定病毒滴度(Rho等人,1981)。

HIV-1 env互补试验

在不存在或存在不同量的化合物(5,10和20uM)的情况下,在37℃下将Jurkat细胞(1x106)与3000 3H cpm RT单位的重组CAT报道病毒一起温育。感染4天后测定细胞的CAT活性。用Sigma图(Jandel Science)进行非线性回归分析,计算抑制HIV-1早期复制50%(EC50)所需的化合物浓度。只有线性范围内的结果(HIV-1 LTR驱动的报道基因CAT基因表达,即氯霉素转化为乙酰氯霉素超过50%)才得以阐述。

细胞毒性测试

用MTT法检测化合物对Jurkat细胞的杀伤作用(Mosmann,1993)。

HIV-1 DNA的实时定量PCR分析

在存在或不存在药物的情况下,用30000 3H cpm RT单位的HIV-1 HXBc2 CAT病毒感染Jurkat细胞(1x106)(雷特格韦以0.5uM使用,依法韦仑以0.1uM,番泻苷A以20uM,番泻苷B 以20uM和RDS1760以25uM)。根据生产商的说明,用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen,Limburg Netherlands)在感染后16小时从处理和未处理的细胞中纯化总细胞DNA,并且在37℃用20U/ml的DpnI处理2小时以去除污染性质粒 DNA(Munir等,2013)。

采用定量实时聚合酶链反应(QPCR)检测早期(负强力终止链)和晚期(Gag基因)逆转录产物和HIV-1总DNA,如前人所述(Yu等人,2008;Doitsh等人,2010;Cheney和McKnight,2010)。采用套式Alu-gag PCR方法检测HIV-1整合DNA(Yu等人,2008;Liszewski等人,2009),并作了一些修改。使用Ampli-Taq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems,Monza,Italy)进行预扩增反应,并由一个循环的变性(10分钟95℃),39个扩增循

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