用表观遗传学综合分析的方法揭示雌性小鼠生殖干细胞单能性中蕴含的独特表观遗传特征外文翻译资料

 2022-05-02 22:52:51

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用表观遗传学综合分析的方法揭示雌性小鼠生殖干细胞单能性中蕴含的独特表观遗传特征

摘要

背景：生殖干细胞在生物体生殖能力的塑造方面发挥着至关重要的作用。虽然这种生殖干细胞的特征已经被广泛研究过，但是人们对哺乳动物生殖干细胞基本性质的调控机制仍然知之甚少。

结果：我们以小鼠雌性生殖干细胞为对象，先后建立了几种组蛋白修饰（H3K4me1, H3K27ac, H3K4me3, 与 H3K27me3）、DNA甲基化、RNA聚合酶II结合位点的基因组图谱，并进行了转录组分析。通过对比胚胎干细胞与雌性生殖干细胞的增强子区域，我们找到了涉及生殖干细胞特征确定的谱系特异性增强子。我们的研究结果进一步表明，DNA甲基化主要通过抑制体细胞程序作用于雌性生殖干细胞的单能性维持，并且通过与雄性生殖干细胞对比，发现DNA甲基化可能参与性别身份的维持。此外，我们证明了Prmt5的下调可以触发分化，从而揭示了Prmt5在维持女性生殖干细胞未分化状态中的作用。

总结：本研究确定的全基因组表观遗传特征和转录调节子为理解小鼠雌性生殖干细胞的基本特征提供了宝贵的研究资料。

背景

生殖干细胞（Germline stem cells，GSCs）对于世代之间的基因组传递至关重要。GSCs虽然只具有单能性，但是具有可以不断产生配子的独特功能。近年来，人们进行了大量研究致力于理解原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）的特征与受精卵受精后获得全能型所必需的深度表观遗传重编程特征（包括全基因组DNA甲基化和组蛋白重塑），而对于掌控哺乳动物雌性生殖干细胞基本特征的调控机制知之甚少。长期以来的观点是，雌性哺乳动物出生时丧失了产生卵母细胞的能力。然而，这一概念已经被最近的研究推翻，这些研究表明不同种雌性哺乳动物出生后的卵巢中有雌性生殖干细胞的存在。因此，研究人员需要更多地关注雌性生殖干细胞未分化状态及单能性的维持的机制探究，这对理解哺乳动物生殖干细胞生物学至关重要。

关于遗传学与表观遗传学调控机制之间紧密联系的知识对于理解干细胞的基本特征和它们的分化有着重要作用。在发育和细胞命运决定的过程中，除了谱系特异性转录因子指导的遗传程序调控之外，基因组表观遗传学修饰也发挥着积极作用并构成了除基因组序列之外的另一层调控。胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的表观遗传图谱的构建已经完成。例如，研究发现胚胎干细胞中的一些启动子区域被H3K4me3与H3K27me3共标记，这些区域被叫做二价结构域。这些二价基因在ESCs中处于悬而未定的的状态，在下游的发育阶段可以被激活。随后，我们对H3K4me3与H3K27me3的全基因组分析发现，组蛋白修饰的不同组合可以调控不同的转录模式，并且参与了ESC基本特征的构建。一项关于H3K4me1和H3K27ac（标记增强子的组蛋白修饰）的研究表明，这两种修饰是细胞类型特异性的，并且参与细胞的身份决定。由于缺乏可识别的和一致的序列特征，在一般情况下，识别和表征调控DNA的元件（例如启动子和增强子）非常困难，但表观遗传分析的方法在应用于ESCs的研究时，已经被证明是描述这些元件的强有力工具。同时，这些表达谱分析为理解干细胞生物学提供了方法和思路。

在之前的报道中，我们获得了小鼠雌性生殖干细胞系，并证明了FGSCs被移植到不育小鼠的卵巢中后可以进行卵子发生并产生后代。虽然这项研究被认为对基础研究和医学都有着重要作用，但FGSCs身份的调控机制尚不清楚。在这里，我们进行了大量的表观基因组分析和RNA测序（RNA-Seq）分析，以了解小鼠FGSCs中的表观遗传和遗传控制机制。

结果

FGSCs有种系特异性基因表达特征：

我们首先通过检查与生殖系统发育相关的分子特征来对培养的FGSC进行表征。免疫细胞化学分析表明，FGSCs的种系特异性标记物Mvh和Fragilis检测结果均呈阳性（见附加文件1：图S1a）。然后我们通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测了其他生殖细胞特异性标记物的表达。我们发现Dazl和Stella在FGSCs中表达（附加文件1：图S1b）。本研究中检测到的特征与我们之前报道的观察结果一致。

为了全面了解FGSCs的转录模式，我们用链特异性RNA-Seq进行了mRNA转录谱分析（图1a），并将我们的数据与来自ESC的数据进行了比较。与ESCs特异性表达Nanog和Sox2不同的是，我们发现Ifitm3 / Fragilis，Ptx3和GM1673在FGSCs中特异性表达（图1b）。此外，我们发现Akt1在FGSCs中高表达（Akt1通路参与小鼠生殖干细胞的自我更新过程）。 Piwi蛋白与piwi互作的RNA（piRNA）相结合，实现生殖系统发育期间重复元件的沉默。有趣的是，我们观察到piwi蛋白Mili，Miwi和Miwi2没有活跃表达，可能是由参与配子生成的Piwi-piRNA通路调节实现的。因此，这些观察证实了FGSCs已知的分子标记。

FGSCs染色质标记的大规模绘图

为了探索染色质状态及其对FGSC特征的影响，我们通过染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing ChIP-Seq）的方法对四种组蛋白修饰（H3K4me1，H3K27ac，H3K4me3和H3K27me3）和RNA聚合酶II结合位点构建全基因组图谱。我们还通过MethylCap-Seq分析了全DNA甲基化情况。此外，我们使用RNA-Seq测量了基因表达水平，并生成了超过108亿个用于检测FGSCs中基因表达的独特图谱读段（reads）（图1a;附加文件1：表S1）。对于每个高通量测序分析，至少进行了两次生物学重复，这些重复的相关性很高（见附加文件1：图S2a）。所有数据集已存入公共数据库。

测序数据已经在整合基因组查阅器（Integrative Genomics Viewer，IGV）中通过在FGSC基因组上产生ChIP片段的密度归一化柱状图实现可视化。组蛋白修饰和DNA甲基化的图谱显示出与其功能一致的信号分布，例如，H3K4me3被认为是转录起始的标志，主要定位于启动子。在研究中，我们发现90％的H3K4me3位点位于启动子区域。一个恰当的例子是，在Ifitm3 / Fragilis（编码用于分离构建FGSC细胞系的蛋白）的启动子处存在很强的H3K4me3信号。 H3K27ac和RNA Pol II与转录活性有关，我们发现它们在FGSCs中的启动子区高度富集。此外，我们观察到H3K27me3广泛分布在FGSC基因组中，这与我们在ESCs中发现的类似。综合起来，这些观察结果表明，我们在这里产生的数据集可以用来识别FGSCs中的顺式调控元件。

FGSCs与ESCs中活性增强子的区别

增强子区域以细胞类型特异性的方式被H3K4me1标记，并涉及细胞命运的决定。 此外，这些顺式调控元件可根据H3K27ac的存在进一步分类为“活性”或“稳定”增强子。 与这些观察一致，我们在FGSC中发现了两种类型的增强子位点。两种相对于转录起始位点（transcription start sites ，TSS）的基因组分布检测表明，这些增强子显示出大部分位于远离TSSs的相似分布模式。

ESC和FGSCs都能在体外自我更新，但它们具有不同的发育潜力。为了检测FGSC中独有的潜在调控元件，我们对由H3K4me1和H3K27ac共修饰的活性增强子位点进行了K值聚类分析，并生成了四个主要类别。毫不奇怪，与FCSC特异性活性增强子区域（200 kb内的单个最近基因）相关的基因在FGSCs中表现出比ESC更高的转录活性。为了理解谱系特异性增强子如何作用于FGSC的身份决定，我们用基因组区域富集注释工具（GREAT）进行了基因本体论（gene ontology，GO）分析。我们发现FGSC中控制生殖相关表型的基因特异性增强子峰（第2类）高度富集。这些生殖相关表型包括生殖系统生理机能（例如Notch2，Npr2和Nr2f2）和女性生育能力（如Ptgs2，Ptx3和vrk1）。同时，我们发现ESC特异的活性增强子主要参与胚胎形成，ESC和FGSCs共有的活性增强子主要在有丝分裂细胞周期相关的基因上出现富集。

染色质二价结构域特性在FGSCs中并不广泛存在

据报道，二价结构域染色质涉及了胚胎干细胞的发育可塑性。 我们之前的研究进一步表明，二价启动子在ESC基因组中广泛存在。在这项研究中，我们检测了FGSCs中二价启动子的存在。 令我们惊讶的是，观察到的FGSCs中二价启动子的存在更少。 我们认为，该观察结果的出现不太可能是由于H3K27me3 ChIP-Seq技术出现问题，因为在FGSC中鉴定到了可观数量的H3K27me3标记区域。在一项研究报道了多能神经嵴细胞中类似现象的存在。 这些观察结果表明，除了二价结构域之外，“表观遗传密码”是导致干/祖细胞发育可塑性的原因。

DNA甲基化通过抑制体细胞程序作用于FGSC身份决定

生殖干细胞生物学的一个主要问题是单能性是如何维持的。在标准的生殖细胞中，Blimp1/Prmt5复合物通过产生抑制性的H2A / H4R3me2s，并且在胚胎期从细胞核到细胞质发生异位，从而在单能性的维持上发挥重要作用。此外，我们发现编码Blimp1的基因Prdm1在FGSC中非活跃表达。DNA甲基化是另一个与基因沉默密切相关的表观遗传标记，为了理解FGSC如何维持单能性，我们在FGSC基因组中检测了DNA甲基化的存在。为此，我们通过MethylCap-Seq测序方法获得了DNA甲基化谱，并将我们的数据与前期由MeDIP-seq产生的FGSCs数据集进行了比较。我们观察到ESCs，E11.5 PGCs和FGSCs在全DNA甲基化模式上存在显着差异； FGSC和E11.5 PGCs之间的相关性为0.05，FGSCs和ESCs之间的相关性为0.27。

为理解FGSCs中DNA甲基化的意义，我们用ESCs，E11.5 PGCs和FGSCs的数据集进行了聚类分析;用于GREAT分析的FGSC特异性甲基化启动子区域。值得注意的是，功能注释显示FGSC特异性甲基化基因主要参与体细胞发育过程，包括Hox，Fox和Tbx家族转录因子。虽然被视为沉默表观遗传标记，但越来越多的证据表明DNA甲基化对转录的影响取决于基因组的情况。我们将FGSC基因组的甲基化区域分为三组，并检查了DNA甲基化和转录活性的关系。与以前的研究类似，我们发现含有甲基化启动子的基因的转录水平低于其他两类基因。但令人惊讶的是，我们观察到超过90％的带有甲基化启动子的基因在基因体部分被同时甲基化，这是一个与转录活性相关的表观遗传标记。为了进一步探索FGSCs中DNA甲基化的作用，我们敲低了Dnmt1，发现几个与DNA甲基化有关的体细胞发育相关基因和启动子区域RNA聚合酶Ⅱ结合率显著上调。这些结果表明DNA甲基化对FGSC身份决定起关键作用。

差异DNA甲基化参与FGSCs性别身份的维持

生殖细胞在E13.5前的早期胚胎性腺中，同时具有性别上分化为雌性或雄性的可能性。虽然一般认为生殖细胞的性别主要由来自体细胞的信号分子决定的，但越来越多的证据表明，体细胞和生殖细胞的“性别”必须相互匹配才能正确诱导配子发生。然而，目前还不清楚FGSCs是如何与体细胞匹配以维持性身份的，因此我们需要探究DNA甲基化是否涉及这一过程。

为了解决这个问题，我们将FGSCs中的DNA甲基化模式与酸性亚硫酸盐测序测量的雄性生殖干细胞（MGSCs）中的DNA甲基化模式进行了比较。我们用之前报道的方法分析了DNA甲基化数据集，发现Pearson相关性为0.229，这表明雄性和雌性生殖干细胞之间DNA甲基化相关性较低。我们特别比较了甲基化启动子区域。在11936个基因的甲基化启动子区域中，只有2689（22.5％）表现出相似的DNA甲基化水平，而大多数表现出性别特异性甲基化模式。对这些雌性特异性甲基化基因的GO分析表明，它们与雄性发育相关。例如，Bcl211，Nr0b1和Sfrp2在小鼠雄性特征的发育中发挥着关键作用。在这里，我们观察到这三种基因的启动子在FGSC中完全甲基化并在MGSC中低甲基化。转座因子基因占据了小鼠基因组的37％，我们研究了与CpG岛重叠的六类转座因子的DNA甲基化情况。与MGSC中长散在核元素（LINE）L1，长末端重复ERV1和脑池内A型颗粒（IAP）的较高DNA甲基化频率相反，DNA转座子，SINE B1和SINE B2在FGSC中甲基化频率更高。我们还调查了印迹基因座上的DNA甲基化，观察到印迹基因座差异甲基化区域（DMRs）的性别特异性DNA甲基化模式。总之，这些结果表明DNA甲基化涉及FGSCs的性别身份维持。

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