组织培养并通过基因枪技术将反义DFR基因转化到莲（Nelumbo nucifera Gaertn）中外文翻译资料

 2022-05-29 22:48:46

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组织培养并通过基因枪技术将反义DFR基因转化到莲（Nelumbo nucifera Gaertn）中

Raveevatoo Buathong , Kanjana Saetiew , Salak Phansiri , Nonglak Parinthawong ,Sumay Arunyanart

摘要

在莲中研究了外植体和植物生长调节剂对愈伤组织诱导、植物再生以及利用基因枪技术进行转化的影响。当在加有40uM NAA和0.5u MTD的MS培养基上培养8周时，大小为3mm的顶芽可发育形成胚性愈伤组织。之后将所有的胚性愈伤组织转移到植物激素配比分别为0,40,50和60uM的6-BA的MS培养基中，分别培养8周后发现在加有50uM 6-BA的培养基中达到最高数量的芽。之后用来自莲子胚顶端大小约3mm的芽进行植物组织培养，产生愈伤组织后分化形成的芽，使用基因枪用于研究莲花的转化。使用pCAMBIA2301反义DFR质粒，质粒上带有beta;-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）作为报告基因，新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）作为筛选基因，反义二氢黄酮醇4-还原酶（反义DFR基因）作为目标基因。基因枪法过程保持氦气压力为1100磅/平方英寸，目标距离为6厘米时产生最多数量的蓝色斑点（4.8点/射束）。然而，如通过聚合酶链式反应和逆转录聚合酶链反应分析所证实的，稳定转化仅使用1100psi的氦气压力和9cm的目标距离才能实现。实验表明莲花基因转化的可能性，通过这种方法，我们可以设计以及修饰植物的某些具体特性。

1、简介

莲(Nelumbo nucifera Gaertn.）是泰国经济和观赏重要的水生植物。这种植物的种子，嫩叶和根状茎均可被食用，它的花瓣和雄蕊均可药用因此它也是众所周知的药用植物，它的花与佛教密切相关，在佛教中它被用作象征和装饰性物质。泰国有四种商业莲花品种，通过育种计划只有有限的发展。愈伤组织诱导和再生方案的发展将为该植物的进一步商业开发提供有用的工具。虽然已经通过使用X射线，gamma;射线和化学诱变剂进行突变诱导产生了一些变异品种，但是这种方法不能针对特定特征。特别是我们期待获得花色的变化，这在泰国品种中仅限于白色和粉红色。

分子育种为植物育种提供了强有力的方法，因为它可以针对特定的植物特征而不改变其他植物特征。与花色有关的一些实例如下：通过将CHS或DFR基因以正义或反义方向转移到蝴蝶草中,通过表达类黄酮途径的两个独立转化的DFR和花青素合酶（ANS）基因,对连翘花色进行花色工程改造，通过将单一CHS， CHI和DFR基因转移到烟草中，与野生型烟草相比，在花色上会产生具有各种颜色的烟草植物，以及用正义和反义DFR基因转化Metlastoma malabathricum 和Tibiotina semidecandra（野牡丹）的实验。

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）在花色素的生产中起重要作用，而花色素可以影响花色。由于这些酶具有非常特定的底物需求，这导致花青素，儿茶素和原花青素的不同模式的积累。通过对这些酶的操作为这条途径的代谢工程开辟了许多可能性，这些可能使莲花中一些有用的变异产生价值。

这项工作研究了从一系列外植体和培养基的愈伤组织中再生莲藕，并使用基因枪法和DFR基因作为模型优化了芽的转化。本研究的目的是调查一系列外植体和培养基类型对莲的生长和再生的影响，并确定（1）外植体类型和植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响，（2）植物生长调节剂对莲愈伤组织芽形成的影响;（3）通过基因枪法将反义DFR基因转化到莲中。

2、材料和方法

2.1外植体和植物再生的原材料

莲子先用流水冲洗60分钟，在70％乙醇中漂洗1分钟，之后在3％（v / v）NaOCl（50％Clorox加两滴吐温20）中表面灭菌20分钟，并用无菌蒸馏水冲洗三次。MS培养基：加8g琼脂（商品级）作为所有实验的基础培养基。培养基分装到培养皿中，每个培养皿含有20ml培养基。将pH调节到5.6后将培养基在121℃ 高压灭菌20分钟。培养物在25plusmn;1 ℃培养，在白色荧光灯下光周期16h，每4周换一次培养基。

通过在含有各种先前报道的植物生长调节剂（PGR）组合的培养基上通过两次独立实验培养外植体来诱导愈伤组织。在第一个实验中，通过在含有以下PGR组合的MS培养基上培养来检查来自合子胚的叶柄的愈伤组织产生：

40uM NAA和0.5uM TDZ

4.52uM 2,4-D和0.45uM TDZ

10uM 2,4-D和0.5uM BA

9uM 2,4-D和0.8uM BA

18.1uM 2,4-D和2.22uM BA

10uM的毒莠定和1uM的激动素

4.14uM的毒莠定和4.64uM的激动素

11.27uM的 麦草畏和4.14uM的 毒莠定

11.38uM三十烷醇和1.1uM BA和2.85uM IAA

通过以下方案对外植体生长进行评分：（1）变成深棕色并且没有生长的外植体，（2）形成绿色紧凑愈伤组织的外植体，（3）形成绿色胚胎发生愈伤组织的外植体。

在第二个实验中，从胚胎顶芽通过培养含有植物生长调节剂的以下组合的MS培养基上研究：

40uM NAA和0.5uM TDZ

10uM的毒莠定和1uM的激动素

4.14uM的毒莠定和4.64uM的激动素

11.27uM的 麦草畏和4.14uM的 毒莠定

11.38uM三十烷醇和1.1uM BA和2.85uM IAA

在每个实验中使用具有六组的随机完整组织设计，并且每个实验单元使用五个外植体。将愈伤组织的生长记录为形成愈伤组织的外植体的百分比和愈伤组织重量。

培养8周后，如Arunyanart and Chaitrayagun（2005）所进行的研究一样，将胚性愈伤组织转移到加有0,40,50或60uM BA的MS培养基中以研究愈伤组织再生。采用随机完整的块设计，每个实验单元使用三个块（每块15个外植体）和5个外植体，并且将枝的生长记录为枝数，叶数，枝长度和叶长。

2.2植物和质粒制备

将使用大小在3mm左右的芽在含有40uM NAA和0.5uM TDZ的MS培养基上培养8周用于胚性愈伤组织诱导。诱导出胚性愈伤组织之后将其在含有0.5uM BA的MS培养基培养12周以再生芽丛，并用作转化植物材料，因为胚胎产生愈伤组织在轰击后对选择培养基不具抗性（数据未显示）。将再生的芽丛转移到渗透培养基（含有2M甘露醇和2M山梨糖醇的MS培养基）中培养16小时，随后转移到培养皿（9cm）中，培养皿置于无菌圆形沃特曼滤纸的中心（直径2.5cm）。

在该实验中使用质粒为DNA pCAMBIA2301anti-DFR（图一）， pCAMBIA2301反义DFR质粒含有编码beta;-葡糖醛酸糖苷酶的gus报道基因，编码新霉素磷酸转移酶的选择性nptII基因和缩减至670bp的反义DFR基因。使用小分子萃取试剂盒，从大肠杆菌（DH5alpha;）中分离pCAMBIA2301反义DFR质粒，并在1.0uM金颗粒上沉淀，简言之，将下列组分加入到1.5ml Eppendorf管中含有100 微升的金颗粒（6毫克加入于50％甘油）搅拌加入：5微克质粒DNA，50微升2.5M的CaCl 2，和20微升0.1M亚精胺。将混合物在冰上静置10分钟，然后以13,000rpm离心 。弃去上清液，将沉淀重悬于50ul 100％乙醇中。对于每次轰击转化，将10ul悬浮的DNA包被的金颗粒液铺展在宏载体的表面上。

图1.使用pCAM2301质粒，含有nptII, anti-DFR, gus还有 CaMV35S启动子，用其构建T-DNA载体。

2.3基因枪法

轰击室粒子输送系统在28英寸汞柱的压力下被抽成真空。实验设计中，使用2times;2因子随机化完全阻断，每个实验单元10个外植体。将外植体用在不同爆破片压力（1100和1350psi，分别相当于7584.23和9307.92kPa）下在目标距离6和9cm处用被DNA包被的金颗粒轰击。轰击后四小时，将射束从渗透培养基转移至再生培养基（含有50uM BA的MS培养基）。在再生培养基上培养4周后，将外植体转移到选择培养基（MS培养基中加入50uMBA和50mg/L卡那霉素）培养8周，并在含有选择剂的新鲜培养基中每2周进行传代培养。然后将存活的枝条簇转移到补充有4.44uM BA和 0.54 uM NAA的MS培养基中以获得枝条伸长。

2.4 GUS组织化学测定

轰击后3天测试瞬时gus基因表达。所述每个处理的10个样品在37℃下在5-溴-4-氯-3-吲哚基-d-葡糖苷酸（X-gluc）溶液中温育24小时，并用70％乙醇洗涤几次。

2.5 特定的转基因植物的PCR分析

使用Doyle和Doyle（1987）描述的方法从卡那霉素抗性培养物的叶组织中分离基因组DNA，使用以下引物5#39;ATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGC3#39;和5#39;ACGCGGTGATACA TATCCAGCCAT3#39;，通过扩增该基因的563bp片段确定gus基因的存在。用于扩增nptII基因的256bp片段的引物是5#39;CCATGATATTCGGCAAGCAGGCAT3#39;和5#39;ATCCATCATGGCTGATGC AATGCG3#39;，用于扩增抗—DFR基因的大约800bp片段的引物是5#39;AGGGATGA CGCACAATCCCACT3#39;和5 #39;TCGCAAGAC CGGCAACAGGA3#39;。反应混合物包括20ng基因组DNA，0.125mM dNTP混合物， 2.5mM MgCl 2，含有(NH4)2·SO4的 1times; Tag缓冲液，引物和0.1 单位Tag DNA聚合酶。用无菌蒸馏水将最终体积调节至20ul。所述的gus和的nptII基因的热循环是如下：一个循环94℃下5分钟，30个循环为94℃1分钟， 64 ℃45秒，一个循环为74℃1分钟和72 ℃10分钟的一个循环。反DFR的热循环基因如下：94℃5分钟的一个循环，94℃30秒，60℃45秒和72℃1分钟的34个循环，以及72℃5分钟的一个循环。PCR产物在1％TAE琼脂糖凝胶上电泳。

2.6 RT-PCR分析稳定转化

使用Provost等人开发的方法从卡那霉素抗性PCR阳性植物的叶组织中提取总RNA。根据制造商的说明使用用于RT-PCR的SuperScript TM III第一链合成系统（Invitrogen）和oligo（dt）进行第一链cDNA合成。使用以下引物扩增该基因的256bp片段来测定nptII基因的表达 ：5#39;CCATGATATTCGGCAAGCAGGCAT3#39;和5#39;ATCCATCATGGCTGATGCAATGCG 3#39;。用于扩增 反义DFR基因的〜450bp 片段的引物是5#39;ACACGAAGTACATCCATCCGGTCA3#39;和5#39;TTCTTGGCTGGTCATGAAGCTCCT3#39;。用于扩增nptII的PCR条件和反义DFR基因包括94℃5分钟，30个循环的变性（94℃，1分钟），退火（64℃，45秒）和延伸（72℃，1分钟），最后在72℃ 延伸10分钟。PCR产物在1％TAE琼脂糖凝胶上电泳。

2.7 统计分析

每周观察培养物。所有数据均使用ANOVA和Duncan的多重范围测试与SAS程序进行分析。

3 结果

3.1 愈伤组织诱导

在培养8周后，与具有生长素和细胞分裂素的任何组合的培养基相比，来自胚外植体的顶芽产生了愈伤组织生长的更好并且与来自胚外植体的叶柄相比（数据未显示）改善了胚性愈伤组织生长的形成。然而，从NAA和TDZ的组合获得的愈伤组织增长的43％是胚性愈伤组织，而其他组合仅产生愈伤组织。在含有 40uM NAA和 0.5uM TDZ的培养基上培养的胚胎的顶芽表现出最大的生长（见表一），在含有NAA和TDZ的培养基上培养的外植体在培养的4周内培养胚性愈伤组织，愈伤组织持续生长至第8周。8周后愈伤组织的生长减少，愈伤组织在12周内变棕色或死亡。胚外植体的顶芽扩大并在切割表面形成致密的白色和绿色愈伤组织（图2a）。来自胚胎的叶柄外植体产生绿色易碎愈伤组织，特别是在切割表面产生最多（图2b）。

表1.植物生长调节剂对培养8周后莲藕顶芽愈伤组织诱导的影响

图2.从顶芽培养的愈伤组织和胚胎培养8周的叶柄外植体。（a）来源于在含有 40mu;MNAA和 0.5mu;MTDZ的MS培养基上培养的胚胎顶芽的胚性愈伤组织。（b）来源于在含有4.52mu;M2,4 -D和0.45mu;MTDZ的MS培养基上培养的胚胎的叶柄外植体的易碎愈伤组织

3.2 芽的诱

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