淡水藻类的一种感官视紫红质的7-跨膜蛋白的13C 和 15 N固体核磁共振信号归属外文翻译资料

 2022-05-29 22:52:52

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淡水藻类的一种感官视紫红质的7-跨膜蛋白的13C 和 15 N固体核磁共振信号归属

摘要：淡水藻类的一种感官视紫红质（ASR）是一种独特的微生物视紫红质，它显示了光学机理，与可溶性转导蛋白相互作用，并可能参与基因调控。在这篇文章里，我们展示了重组在脂质的淡水藻类的一种感官视紫红质几乎完整的13C 和 15 N光谱，获得了二维和三维的魔角旋转固体核磁波谱13C交替标记的样品，得到的化学位移可以用来表征蛋白质的主链结构。化学位移表明脂质-重组淡水藻类的一种感官视紫红质拥有一折叠结构，这个折叠与早期用X射线研究得到的结构相似，但两者也有一些重要的不同之处。固体核磁共振谱仪（SSNMR）用来检测细胞质端的一些残余物的双构象。

关键词：淡水藻类的一种感官视紫红质 细菌视紫红质 魔角旋转 固体核磁共振 化学位移 二级结构

生物背景：

淡水藻类的一种感官视紫红质（ASR）是在淡水蓝杆菌的基因组中发现的一种独特的微生物紫质，PCC 7120，与其他的细菌和古细菌中有一些同源性（Jung等人，2003;Ugalde等人2011）。淡水藻类的一种感官视紫红质（ASR）是一种由7个跨膜螺旋包组成的多跨膜蛋白质，具有共价附着的视网膜染色质。根据光照的波长，淡水藻类的一种感官视紫红质（ASR）可以在两种稳定的构象之间切换，也可以显示光致变色性（Vogeley等2004; Kawanabe等，2007）。光诱导淡水藻类的一种感官视紫红质（ASR）结构变化（Shi等人2006; Kawanabe等人2008; Kondoh等人2011; Wang等人2011b）可以改变它与可溶性转导蛋白的相互作用，启动信号转导级联。这种级联涉及到转导蛋白与DNA的相互作用，这也许会调节与光合作用和生物钟有关的各种蛋白质的表达（Jung 2007，Wang等人，2011a）。

X射线晶体学提供了蛋白质在2 A°的高分辨率结构分辨率，并揭示了7TM alpha;-螺旋束的整体结构，类似于其他微生物视紫红质，但具有更多极性和水合的细胞质一半（Vogeley等，2004）。 然而，发现电子密度与同时存在两种构象的视网膜一致，反式和13-顺式。 同样，形成Lys210和Ser86的席夫碱通过氢键网络与之相连，也发现它们处于交替构象中。此外，由于无序而无法观察到其中一个细胞外环。

最近在脂质中重建的均匀13C 和 15 N标记ASR的魔角旋转研究表明脂质中的ASR构象不同于晶体环境中的ASR构象(Shi et al. 2011)。 主要区别在于高度有序的B-C环，不间断的螺旋G和视网膜的单一构象（以及Lys210和Ser86），表明视网膜在黑暗状态下处于全反式构象，与耳廓提取数据一致（Kawanabe 等2007）。

在统一标记的ASR样品上获得的数据不足以产生完整的任务并获得蛋白质的完全二级结构（Shi等2011）。 其中一个关键的并发症是灵敏度和分辨率不足以检测庞大的芳族侧链并确定其类型。 在这里，我们展示了进行的其他2D和3D实验的结果。在1,3或2位标记的甘油上生长的样品，这使我们能够获得几乎完整的主链和侧链13C 和 15 N ASR化学位移分配。 新的分配可用于更好地表征蛋白质骨架构象和拓扑结构，例如螺旋边界，二级结构扭曲以及环和转角的构象。 本研究为ASR结构和动力学以及与其可溶性转导蛋白的相互作用的进一步现场调查奠定了基础。

方法和实验：

先前描述了表达同位素标记的ASR的方案（Shi等，2011）。 简而言之，将BL21-Codonplus-RIL大肠杆菌细胞用编码在229位截短的C端69 His-标签的ASR（Shi et al.2006）的质粒转化，并在30℃在M9基本培养基中培养，使用 作为碳源和氮源的每升培养物中含有4g 1,3-或13C或2-13C标记的甘油和1g 15N-氯化铵。 当细胞密度达到A 600 = 0.4OD时，ASR的表达由1mM IPTG诱导。 在诱导时以7.5mu;M的浓度外源添加在位置13和20标记的视网膜13C以再生表达的视蛋白。 将膜部分在4℃下溶于1％DDM中，并用Ni2 -NTA树脂（～5mg ASR从1升培养物中纯化）。

纯化的ASR用脂质：蛋白质比例为1：2（w / w）重构到DMPC / DMPA（9：1w / w）脂质体中，使用生物珠去除去污剂。通过超速离心150,000g收集脂质体持续1小时，并在薄壁3.2mm NMR转子（大约8mg蛋白质）中心包装用于SSNMR测量。SSNMR测量在Bruker Avance III光谱仪上以800MHz进行，使用无E探针，旋转频率为14.3 kHz，有效样品温度为5℃。对使用1,3- 13 C和2 -13 C标记的甘油（分别表示为1,3-ASR和2-ASR）生长的两种ASR样品进行以下实验：2D 13 C-13 C相关实验（DARR; Takegoshi等人，2001; Morcombe等人，2004）混合时间为100ms，3D NCOCX实验，DARR混合时间为100ms，3D NCACX实验，DARR混合为100ms。使用带选择性交叉极化建立13 C转移（Baldus等，1998）。 90 kHz的SPINAL64解耦（Fung et al。2000）用于直接和间接维度。所有化学位移均使用DSS参考（Morcombe和Zilm 2003）。

分配和数据存储

在我们以前对均匀13 C，15 N标记的ASR进行的工作中，我们使用3D异核相关光谱法（Shi et al.2011）为169个氨基酸分配了大部分共振。检测到另外46个旋转系统，但无法分配。它们大多含有少量共振，不能被类型识别，和/或不能被可靠地连接到连续碎片中。这里给出的稀疏标记的1,3-ASR和2-ASR样品的二维和三维实验给出了较高分辨率的光谱，这可以解决检测到的自旋系统的附加共振。新检测到的共振进一步提供有关未分配的sys-并协助连接纺纱系统，特别是纺纱系统那些对应于芳香族残基和残基的长侧链，即亮氨酸和异亮氨酸（图1）。在另外，稀疏标记产生更高的光谱分辨率的芳香侧链，其中许多可能是从二维碳 - 碳关联谱分配（图1b，c和图S1）发表的意见（Sperling等，2010）。另外，13 C 13视网膜的共振在167.9 ppm处得到很好的解决1D13 C谱和C 13 -C 20相关性很好地解决了在2D光谱中，导致这些视网膜的分配共振。这里介绍的2-ASR和1,3-ASR样本的二维和三维实验结果与以前公布的统一的13 C，15 N标记的ASR相结合，并允许改善分配的范围。这里介绍的1,3-ASR样本与之结合起来以前公布的统一数据13 C，15 N标记ASR，并允许提高任务的范围。一个新分配的残基的连续步行的例子在图S2中给出。指定的化学位移为206在表S1中给出了229个残基，并且已经得到存入BioMagResBank（http://www.bmrb.wisc.edu）作为BMRB条目18595。

新分配的化学位移允许完成ASR的二级结构分析，并更好地定义螺旋边界。化学位移指数（CSI）分析（Wishart et al.1992; Luca et al.2001）如图2所示。具体而言，发现螺旋A和B的细胞质边界分别延伸到S26和Y35。我们显示螺旋A包含在位置F22的畸变，并且呈现更完整的螺旋E的细胞质侧和胞质环A-B和E-F的指定。有趣的是，我们观察到位于细胞质侧的许多残基的两组化学位移，如图S3所示：螺旋B的M41，F42; A91，M92位于C-D环中的螺旋C和I95中; E-F环中的A152和K153;和Y165位于螺旋F中。检测到的双重构象异构体之间的化学位移差异在0.2-0.8ppm范围内（表S1），可能表明两种略微不同的构象或缓慢的交换动力学。这里介绍的几乎完整的任务可作为进一步研究ASR结构和动力学及其与换能器相互作用的基础。

致谢本研究得到了加拿大自然科学和工程研究委员会，加拿大创新基金会和安大略省研究与创新部的支持。S.W. 由加拿大健康研究所博士后研究员支持。V.L. 拥有加拿大生物物理研究所主席。 我们感谢Kwang-Hwan Jung教授（韩国汉城Sogang大学）为编码C-末端69 His-标记的ASR的质粒的慷慨馈赠。

固体核磁共振波谱法检测Y145Stop人朊蛋白淀粉样纤维中的分子间排列

摘要：人类朊蛋白Y145Stop突变体huPrP23-144与PrP大脑淀粉样蛋白血管病（一种遗传性淀粉样变性疾病）有关，也可作为研究淀粉样蛋白菌株分子基础的有价值的体外模型。通过魔角旋转（MAS）固态NMR光谱对huPrP23-144淀粉样蛋白的先前研究揭示了C-末端附近的致密beta;-富集淀粉样蛋白核心区和非结构化N-末端结构域。在此，着重于理解huPrP23-144原纤维的高阶结构，我们使用MAS NMR技术探讨了淀粉样蛋白核内beta;链的分子间排列以及由15N标记蛋白质和13C-用[1,3- 13 C 2]或[2- 13 C]甘油制备的huPrP23-144。涉及骨架原子的众多分子间相关性在2D15 N-13 C谱明确表明beta;折叠核心的整体平行寄存器对齐。另外的实验报道了分子间15 N- 13 CO和15 N-13个Calpha;偶极耦合产生的预测链间距在平行beta;-折叠片典型4.7〜4.8Aring;距离的〜10％范围内

朊病毒蛋白（PrP）构象转化为有序的富含beta;-折叠的淀粉状蛋白样聚集体与一组称为传染性海绵状脑病的致命性神经退行性疾病的发病机理相关。 尽管一度引起争议，通过错误折叠的聚集体充当自我复制感染因子的“蛋白质纯化”机制正在变得被广泛接受，特别是鉴于最近发现可以从纯化的PrP 2体外产生感染性颗粒并观察关于基于构象的遗传在真菌中。虽然朊病毒的增殖能力似乎被编码在PrP聚集体的三维（3D）结构中，但是这种现象的分子机制目前在原子级细节中还不能很好地理解。

人类PrP的C端截短的Y145Stop变体（huPrP23-144）与可遗传的大脑淀粉样血管病有关。 尽管这种类型的朊病毒病似乎是非传染性的，但我们以前已经表明huPrP23#39;144在体外研究淀粉状蛋白形成的分子基础以及淀粉样蛋白菌株的现象和种子特异性提供了有价值的模型。 最近，我们开始了由重组13 C，15 N富集的huPrP23-144制备的淀粉状蛋白原纤维的结构和构象动力学的多维魔角旋转（MAS）固态NMR研究。 这些研究揭示huPrP23-144原纤维包含相对刚性的仅由〜30C-末端氨基酸（aa）组成的淀粉样蛋白核心区域，其中beta;-构象中有许多残基。 相比之下，发现一个包含aa〜23〜111的大的N端结构域是一个高度灵活的随机线圈样构象异构体。

在这里，重点是深入了解huPrP23-144原纤维的高级结构，我们通过MAS固态核磁共振光谱探测了淀粉样核心区中beta;-链的分子间排列。固态核磁共振方法非常适合这种类型的分析，并且以前已用于研究许多肽衍生的原纤维的核心结构，例如beta;-淀粉状蛋白和胰淀素，转甲状腺素蛋白和beta;2片段，包括Sup35p-（1-253），Ure2p，beta;2-微球蛋白，HET-s（218-289）和HET-s，以及几个较大的蛋白质或蛋白质结构域。在本研究中，我们利用转移回波双重共振（TEDOR）核磁共振技术和从15 N-huPrP23-144和稀疏13 C标记的huPrP23-144的等摩尔混合物制备的原纤维样品记录2D 15 N- 13 C化学位移相关谱含有大量涉及骨架15 N，13 CO和13 Calpha;核的分子间相关性。我们还评估了分子间15 N- 13 CO和15 N- 13 Calpha;偶极子偶联物，报道beta;-折叠核心内的链间距。

将HuPrP23-14淀粉样蛋白原纤维样品从pH6.4磷酸盐缓冲液中以15:N和13C标记单体的物理混合物以1:1的摩尔比生长，其中13C标记的蛋白质使用[1,3- 13 C 2]或[2- 13 C]甘油基表达媒介。 这种类型的13 C富集，去除了许多单键13 C-13 C偶极和J耦合，并导致改进的光谱分辨

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