补骨脂素负载脂质体纳米载体用于改善皮肤渗透和局部PUVA在牛皮癣中的功效外文翻译资料

 2022-07-08 15:20:18

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补骨脂素负载脂质体纳米载体用于改善皮肤渗透和局部PUVA在牛皮癣中的功效

Sindhu Doppalapudi a , Anjali Jain a , Dhiraj Kumar Choprab, Wahid Khan a*

摘要

补骨脂素联合紫外线A辐射（PUVA）是FDA推荐的治疗严重顽固性银屑病的临床应用疗法。补骨脂素通过插入DNA而起作用，并且在暴露于UV-A时，其形成诱导细胞凋亡的单加合物。补骨脂素的经皮渗透性差、不良皮肤沉积以及与常规局部补骨脂素载体相关的严重烧伤，水疱，色素沉着的不利影响妨碍了局部PUVA的治疗功效和安全性。本研究的目的是配制补骨脂素脂质体纳米载体，以增强局部PUVA治疗银屑病的皮肤渗透性，安全性和有效性。 两种不同的脂质体组合物，即由DC-Chol组成的阳离子脂质体，制备由卵磷脂，胆固醇和四肉豆蔻酰心磷脂组成的胆固醇和阴离子脂质体用于局部递送补骨脂素。 脂质体载体在尺寸，zeta电位，包封率，稳定性，体外药物释放和体内研究方面进行了表征。两种脂质体都是粒径接近100纳米，阳离子脂质体的Zeta电位和包封率分别为 25.8mV和75.12％，阴离子脂质体分别为-28.5mV和60.08％。脂质体真皮分布显示，两种脂质体载体在溶液中的渗透性较高。类似地，皮肤渗透研究表明补骨脂素与脂质体载体的渗透增加了5倍。局部应用补骨脂素脂质体凝胶在咪喹莫特诱导的银屑病斑块模型上减少银屑病的症状和关键银屑病细胞动脉如肿瘤坏死因子-alpha;，IL-17和IL-22的水平。总之，已发现的补骨脂素脂质体载体是有希望被开发的，并且可以找到局部PUVA在牛皮癣中应用的最佳安全性和有效性。

一、简介

银屑病被认为是一种慢性自身免疫性炎性疾病，其特征在于鳞片覆盖的增厚的炎症性皮肤病变（Traub and Marshall，2007）。这是一种具有重大身体，心理和社会影响的破坏性疾病 (Su and Fang,2008)。有几种治疗方法可用于通过靶向角质形成细胞来减轻银屑病的症状、炎症和血管生成，导致治疗策略在治疗牛皮癣中的扩展 (Bayliffe et al., 2004)。银屑病治疗模式包括局部治疗，光疗和全身治疗，各种治疗方法各有利弊(Mendonca and Burden, 2003)。光疗即，补骨脂素（PSR） 紫外线A（UVA）辐射（PUVA）减慢减少皮肤细胞增殖并已通过美国食品和药物管理局（FDA）的临床应用 (dos Santos and Eriksson, 2006)。当被UVA光激活时，PSR与核酸的嘧啶碱基进行环加成形成稳定的环加成物并且发现该机理在治疗银屑病中非常有效(Sinico et al., 2006)。

局部PUVA优于系统性PUVA，因为它比后者具有更多优点。含有补骨脂素的局部制剂使用方便，并且由于可忽略的全身副作用和较低的累积UVA剂量而提供更好的依从性(Kc and Karn,2015)。PSR和它的三甲基衍生物（4,5#39;，8 - 三甲基补骨脂素）由于其物理化学性质而适用于局部PUVA (Pathak et al.,1977;Saidetal.,1997)。传统的PSR外用载体，即软膏、洗剂和酊剂，由于其不良的皮肤沉积和PSR的皮肤渗透性弱而需要频繁给药，这又导致不良反应(Zhang et al., 2014b)。除了这些因素之外，由于PSR与UVA的不受控制的反应，这些因素导致严重的日光灼伤，水疱和异常黑色色素沉着。这是游离药物与皮肤从这些可用剂型直接接触的结果(Garg et al., 2010)。与传统剂型相关的这些问题阻碍了局部PUVA的安全性和有效性，其中用于局部递送补骨脂素的纳米载体还需进一步开发。

药物如PSR在通过常规载体递送时引起不良反应被认为是囊泡包封的有趣之处 (Sinico et al., 2006)。脂质体可延长药物在皮肤层中的停留时间(Dragicevic Curic et al., 2010)，增强包封药物的渗透性(Pavelic et al., 2004) ，并用作受控药物递送系统(Dragicevic Curic etal.,2009)。脂质体的组成影响其物理化学特性，如尺寸，电荷，热力学相，层状度和渗透性 (Puglia et al., 2005)。将胆固醇掺入囊泡组合物将影响其稳定性、渗透性和药物包埋(Singla et al., 2012)。脂质体的静电性能影响脂质体的稳定性以及药物的皮肤渗透(Gillet et al., 2011)。

张等人比较了常规脂质体和醇质体对PSR渗透的影响，并显示醇质体的渗透性优于脂质体 (Zhang et al., 2014a)。然而，没有关于带电脂质体被应用于局部递送PSR的报道。带电脂质体被认为是通过经皮途径施用的有希望的药物载体（Gonzalez Rodriguez和Rabasco，2011），因为它们透过皮肤的穿透性增强 （Bozzuto和Molinari，2015）在这项研究中，首次配制了两种不同电荷的脂质体组合物用于局部递送PSR。此外，使用体内牛皮癣模型评估具有PSR脂质体纳米载体的局部PUVA。 图1给出了本研究中的工作大纲，旨在克服与常规PSR相关的问题。

图1

二、材料和方法

2.1材料

PSR购自印度海德拉巴的Prince scientific公司。3beta;-[N-（N#39;，N#39;-二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐[DC-Chol]和1,1#39;，2,2#39;-四肉豆蔻酰心磷脂（CL）（Avanti极性脂质，Alabaster，USA）作为Dr. Reddy#39;s Laboratories Ltd.（海德拉巴，印度）的礼品样品获得。从Glenmark Pharmaceuticals（Mumbai，India）获得咪喹莫特乳膏（5％w / w IMQ乳膏）。（GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited（Mumbai，India））购买Betnovate（戊酸倍他米松软膏，0.1％w / w）（BMV）胆固醇（Chol）从Lobachem（孟买，印度）获得。异硫氰酸荧光素（FITC），L-alpha;-卵卵磷脂（EL）和triton-x获自Sigma Aldrich（密苏里州，美国）。 氯仿，甲醇和乙腈获自Merck Pvt。 （印度孟买）。 甲醛从HiMedia实验室（Thane，印度）获得。 Quantikine小鼠白细胞介素-17（IL-17），白细胞介素-22（IL-22），白介素-23（IL-23）和肿瘤坏死因子-alpha;（TNF-alpha;）ELISA试剂盒购自R＆D Systems，（明尼阿波利斯，美国）。最佳切割温度化合物（OCT）培养基购自Leica Biosystems（Wetzlar，德国）。实验中使用的其他化学品和试剂均为分析纯，购自当地印度。

2.2用于量化补骨脂素的HPLC分析

通过高效液相色谱法（HPLC）进行PSR的平衡，如之前报道的那样进行一些修改（Pires等人，2004）。将PSR溶解在甲醇中以获得1mg / ml的储备溶液。制备了一系列标准溶液，浓度范围分别为2,4,6,8和10mu;g/ ml。 在C-18柱（ODS-3V，尺寸4.6times;250mm）上用自动RP-HPLC（Waters 515 HPLC模型）进行分析，流动相为乙腈：水（60:40，v / v）。 流动相通过0.22mu;m膜过滤器过滤，超声处理并使用。以1ml / min的流速和等度模式进行分析，其中223nm作为检测波长并且注射体积为10mu;l。

2.3脂质体分散体的制备

2.3.1补骨脂素负载阳离子脂质体

通过薄膜水合法制备阳离子脂质体（PSR-CL）（Yang等，2013）。在表1中给出了具有不同摩尔百分比的脂质的阳离子脂质体的组成，DC-Chol从近50至100摩尔百分比变化，和在PSR-CL-1中胆固醇（Chol）从近0至50摩尔百分比变化（1-5），并且在所有批次中药物与总脂质的比率保持恒定在1：5（以重量为基础）。简言之，将不同摩尔分数的3beta;-[N-（N#39;，N#39;-二甲基氨基乙烷） - 氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐（DC-Chol）和Chol与PSR混合并溶于圆底烧瓶中的氯仿中。然后使用旋转蒸发器（Hei-VAP unit，Heidolph，德国）在37℃真空下蒸发氯仿以形成薄的脂质膜。用微孔水使膜水合，使有机相的体积加倍到60℃。水合之后，使用超声波仪（Sonics＆Materials Inc.，Newtown，USA）在40℃振幅和开关脉冲（20s：10s）下将脂质体分散体超声处理5分钟以获得负载PSR的阳离子脂质体。

表1

2.3.2补骨脂素负载的阴离子脂质体

阴离子脂质体（PSR-AL）也使用薄膜水合法制备（Kuo和Lin，2015）。 表1给出了脂质摩尔数不同的阴离子脂质体的组成.L-alpha;-卵卵磷脂（EL），Chol和1,1#39;，2,2#39;-四肉豆蔻酰心磷脂（CL）的比例从几乎不同 40至75摩尔百分比，0至40摩尔百分比和0至25摩尔百分比。 在PSR-AL-（1-5）批次中，约30mol％的Chol，CL比例从接近0％逐渐增加至20％，并且EL的摩尔百分数相对于CL含量以当量比例下降。 在PSR-AL（6-9）批次中，CL摩尔百分比在约20％时，Chol比例从接近40％逐渐降低至0％，并且EL的摩尔百分数以相对于胆碱含量的当量比例增加。简而言之，将不同摩尔分数的EL，CL和Chol与PSR以1：5的总脂质比（在体重基础上）混合，溶解在氯仿中并蒸发。 如上所述通过保持参数恒定将膜水合并超声处理。 还使用如上所述的薄膜水合方法通过用FITC代替PSR使用优化的组合物制备负载异硫氰酸荧光素（FITC）的阳离子和阴离子脂质体（FITC-CL和FITC-AL）。

2.4脂质体凝胶的制备

通过将优化的PSR脂质体分散在15％w / w羟丙基甲基纤维素（HPMC）E15凝胶基质中来制备PSR阳离子和阴离子脂质体凝胶（PSR-CL-凝胶和PSR-AL-凝胶）以获得0.02％w / w PSR的最终浓度。 将这些凝胶在磁力搅拌器（IKA，德国）上以500rpm保持过夜，并允许水合温度。还使用用于皮肤分布研究所需的FITC载脂质体凝胶（FITC-CL-凝胶和FITC-AL-凝胶），FITC通过相同的程序加载脂质体。

2.5脂质体的表征

2.5.1粒径，PDI和Zeta电位

平均粒径和多分散指数（PDI）的平均值，记录所有脂质体批次。 使用Malvern Zetasizer Nano（Malvern Instrument Ltd.，Malvern，UK）通过动态光散射技术测定PSR脂质体的粒度和大小分布。 所有批次都用1:10稀释的微孔水稀释并分析。 测定PSR阳离子和阴离子脂质体的Zeta电位以优化制剂。

2.5.2包封效率

优化的PSR阳离子和阴离子脂质体以15,000rpm离心15分钟以获得沉淀。 然后用0.01％Triton X-100处理获得的脂质体沉淀物以破坏脂质体（Laouini等，2012）。 然后将0.5ml甲醇加入破裂的脂质体中以溶解药物，然后将样品以10,000rpm离心5分钟。 通过使用HPLC方法测定包封药物的浓度。 对所有PSR脂质体批次测定包封率。

包封率通过下面给出的公式计算：

包封效率%=包含的药物量/药品总量*100

2.5.3透射电子显微镜

在JEM 2100（JEOL，日本）透射电子显微镜上记录图像（加速电压：120.0kV）。 在25℃下进行分析，其中将脂质体分散体放置在格栅（Formvar碳涂覆的铜网格）上并使其干燥。 然后将样品用醋酸铀酰染色并再次干燥。将样品彻底干燥后，使用DigitalMicrograph软件（Gatan，Inc.，USA）捕获图像。

2.6脂质体稳定性

优化的脂质体分散体在4℃下储存30天。在预定时间点（0,15和30天）收集样品并进行评估。 通过使用动态光散射技术测量粒径和多分散性指数（PDI）来确定优化的PSR脂质体的稳定性（Gillet等，2011）。样品的Zeta电位也在30天时间点测量。

2.7脂质体凝胶的表征

2.7.1铺展

PSR脂质体凝胶的铺展性通过平行平板测量法进行评估（Marchiori等，2010）。简而言之，将0.5g阳离子和阴离子脂质体凝胶各自置于玻璃板的中央，另一个板同心地置于其上方。将制剂铺展的圆的直径测量为初始直径。之后，按照次序的已知重量的15,20,25,50,100,150和200g以每个重量之间1分钟的间隔逐渐放置在上板上。根据直径的变化测量配方的可扩展性与施加的重量的函数关系。扩展的增加是在垂直和水平轴上每增加一个已知重量之后测量的。根据等式[S =pi;r2]，扩散面积作为施加质量的函数表示，其中S是施加确定质量（g）之后的扩展面积（cm 2），r是每个样品达到的平均半径（cm）。通过将y轴上的扩展区域与x轴上添加的权重作图来获得扩展性分布。所有测量一式三份进行。

2.7.2 流变行为

通过使用模块化小型流变仪（Anton-Paar，USA）进行PSR脂质体凝胶的流变学测试（Guan等，2015）。所开发的凝胶的流动性质在25℃下进行，并且通过将剪切应力从80Pa增加到250Pa来进行测量。使用Anton-Paar的RheoCompass TM软件来解释结果，并将剪切应力与剪切速率以及 剪切应力与粘度。

2.8体外释放研究

使用透析袋法（Katiyar等，2015）进行PSR从脂质体的体外释放，其中在透析袋内取出PSR阳离子脂质体，PSR阴离子脂质体和PSR溶液（相当于200mu;gPSR），体积为 用释放

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