处于生长期的银杏叶中黄酮、酚酸和自由基含量的分析外文翻译资料

 2022-07-22 12:27:03

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处于生长期的银杏叶中黄酮、酚酸和自由基含量的分析

摘要

通过Christ-Muller方法、HPLC和EPR精确测量处于生长期的银杏叶中的黄酮、酚酸和自由基的含量，并讨论了这些参数之间的联系。

关键词：银杏，黄酮，酚酸，自由基.

八月收集的银杏叶作为制药工作（1）。银杏叶中的标准提取物为许多制药准备工作（2）提供了基础。

银杏提取物能够改善大脑及周围组织的血液循环，特别是在较低处的肢体能够保护像眩晕或短期失忆这样的神经系统并且延缓机体衰老。银杏叶中的生物活动（3-8）主要和黄酮类物质的出现有关，例如单黄酮、配糖以及黄酮醇苷、双黄酮、花青素、儿茶素（2，5，9-16）这样的黄酮类物质，还有像银杏内酯和白果内酯（2，3，5，17-18）这样的萜内酯。有一组很重要的成分是银杏酚酸，比如苯甲酸和肉桂酸的衍生物和漆树酸（3，5，6，19-23）。

除了上面描述的生物活动，银杏中的活性成分也起到了清除自由基（4,24-26）的作用.光合作用发生在植物叶片中，有机成分在这里合成，它使用叶绿素Ⅱ吸收太阳能，伴随着氧气的释放。这个过程的机理包括多步单电子转移，所以它和自由基（27）的形成紧密相关。

自由基也可能是通过其他途径产生，比如光分解、热分解、氧化和链式反应（27），除此之外也通过血液中的含铜成分。

这篇文章报道了从六月到十月黄酮含量的变化（双黄酮除外），所有确定的银杏酸（19，20，23），以及植物的营养循环中水解生成的自由基。

双黄酮不包括在研究中，因为这些成分（9，15，16，29）并不和银杏酸结合（在银杏叶中和黄酮类似的结合会发生），事实上这对银杏酸-黄酮富集含量的变化没有影响。

这项工作的下一个目的是分析材料（30，32）中抗氧化剂和自由基清除剂含量变化的联系，以及相关的自由基的含量。此外，铜离子的含量已经被检测以便分析对自由基（28）产生过程的影响。至于叶子收获方面，由于研究在下一个营养循环开展，所以被规定在八月到九月。

实验

植物材料

银杏叶取自生长在Poznan的A·Mickiewicz大学中的银杏树。收获的时间见表1.这些叶子干燥后在室温下贮存。在叶子取样检测之前先进行粉碎并过0.5mm筛。

黄酮的检测

黄酮含量的检测是通过Christ-Muller法（33）使用Specol S-11仪器（Carl Zeiss Jena）在425 nm的条件下转化成槲皮素。结果见表2.

银杏酸的检测

银杏酸通过标准途径（19，23，34-36）分离并水解。和银杏酸一起蒸出的馏分通过水解将其分解，这些从银杏叶样品中得到的组分通过TLC进行分析（19，23）。结果作为定量测定的提示。整个银杏酚酸类物质有儿茶，p-间羟基苯甲酸，香草素，异香素，咖啡因，p-香豆素，阿魏酸和突触酸，水解后用HPLC检测。银杏叶中的微量不明银杏酚酸（20，23）在检测中被忽略了。

自由基的调查

自由基的研究是使用一台射电光谱仪在9.341 GHz下工作使用EPR方法进行的。银杏叶样品放在内径5 mm的石英管内。每个样品的自由基都被转化成EPR信号记录下来作为吸收曲线的一阶导数。EPR曲线通过梯度，线性关系，分裂因子的值和EPR信号（37-39）的强度。结果见表3.八月份收集的叶子的EPR信号的记录见图1.

铜离子的研究

矿物盐中所含的铜离子积累在银杏叶中，用上面测定自由基类似的方法来测定。结果见表4.

结果和讨论

从营养循环期间收集的银杏叶中得到的结果可以从两个层面考虑：

-黄酮含量的变化，银杏酚酸的测定，以及水解后自由基的浓度。

-以上成分之间的关系。

表2中描绘的结果是关于试样1-5中黄酮含量的变化，显示这些与八月的叶子相比其中的含量增加了40%，六月的叶子与十月相比减少了35.2%。后者在这个阶段的研究中是黄酮含量最低的。另一方面，黄叶子在营养循环（6，9，29，40）期间的叶子中有最高含量的双黄酮。

八月叶子中黄酮浓度最高证明了制药企业收割银杏叶的正确时间，制药企业已经规定了包括萜内酯（2）在内的这些成分在银杏叶制剂中的含量。

表2显示了酸性或碱性水解后银杏叶（19，20，23）中所有银杏酚酸含量的变化。在样品5中找到了最高浓度的游离银杏酚酸，在样品3中找到了最高浓度的结合酸。水解后，样品3中的游离银杏酚酸占银杏酚酸的比例为1：6，样品5中为1：0.95.

这些值和黄酮浓度有关。因此，样品3与样品1比较，40%黄酮含量的增加转化成了40.1%银杏酚酸含量的上升，水解后样品5中黄酮浓度下降35.2%，与样品3相比这组银杏酚酸下降35%。

考虑到以上描述的变化，可以确定银杏中识别出的氨基糖苷大多为各种叶子中的黄酮。在十月的黄叶中这些成分也许会随着p-香豆酸的分解而分解。在更早的研究中（23），这个假设似乎被所有的银杏酚酸中最高浓度（75.9%）的p-香豆酸所确认，在水解八月收集的叶子后。并且在十月的叶子中所有银杏酚酸的最高浓度（44.7%）也证实了这个假设。

这些结论由关于银杏叶（40）中黄酮醇苷、氨基糖苷和双黄酮含量变化的调查所支撑。

表3包括EPR方法的结果，显示了银杏叶中自由基的数量。对于所有的样品，EPR谱图中的信号表现为单一非对称线性关系，样品1-4（绿叶）的因子为g=2.0032，样品5（黄叶）的因子为g=2.0029。因子g的值用于识别释放的的自由基。样品5显示，碳自由基的已经掌握（木炭的g因子是2.0029），而样品1-4的值表明，除了碳自由基，另一种自由基也许出现了。样品1-5的EPR信号的峰宽△Bpp随着叶子变老从9.1减少到8.5。△Bpp的I和g因子的变化也许表明了氧自由基数量的减少。自由基的浓度由EPR信号的强度（I）来识别，它和样品中的顺磁中心直接成比例。样品3（八月的叶子）的强度（I=283）最大，而强度最低（I=111）的是样品5（十月的叶子）。

自由基的浓度（表3）和所有游离银杏酚酸、黄酮（表2）的含量之间的关系就像自由基清除剂（30-32）在这些值中的建议相关性。样品5中的所有游离银杏酚酸的含量和样品3比较起来有360.9%的增加，同时自由基含量由样品3中的283减少到样品5中的111.

游离银杏酚酸对于样品5中自由基浓度的影响与抗氧化活性与自由基诱导的概率是一致的，由茶（41）中出现的银杏酚酸和黄酮可以证明。这些茶中的成分与银杏叶（15，19，20，23）中发现和测定的酚类物质非常相似。另一方面，样品3中最高浓度的自由基（I=283）也许与总含量非常低的游离银杏酚酸有关，起到抗氧化性的作用。然而，黄酮类物质类似于银杏酚酸是自由基清除剂，在这个样品中的含量也是最高的。这种情况也许和有一部分黄酮形成了糖苷有关。这个解释似乎被样品3中整个营养循环中水解后得到的总银杏酚酸中的最高含量所证明。根据更早的研究（23），p-香豆酸在这些酸中所占比例达到75.9%。

P-香豆酸也许在氨基糖苷中至少占有一部分。从上面的原因可以看出伴随着高浓度的自由基和它的清除剂，黄酮（32,41）也许能够解释在与苷元的活性对比时二糖苷的抗氧化活性降低的现象。这个解释似乎得到了样品5中自由基浓度、水解后游离的银杏酚酸的总含量和黄酮的确定。这可以总结为银杏叶中从八月到十月的生物转化不仅导致了银杏酚酸的显著增加（360.5%）而且导致了糖苷分解为黄酮苷元和糖基。这个结论似乎被上面引用的更早的研究（40）证明。最可能的是，黄酮发生中和反应转变为自由基（41）强调了这些变化和黄酮的抗氧化性相关。

以上有关银杏叶的调查提供了有关自由基和天然酚酸的清除活动，即确定存在的银杏酚酸和黄酮。单个成分的功效将会成为将来的调查项目。

表4中所给的EPR信号被记录为单非对称曲线，它的因子g在2.135和2.168之间，因此可以指示铜离子的出现（有关Cu2 的因子g在2.006-2.25的范围内）。EPR信号的强度与样品中铜离子的浓度相对应，解释了它会随着植物年龄的增长而增长。

EPR信号也显示了另一种信号，指示了Mn2 （一个六成分的特征谱图）和Fe3 （g=4-5）在银杏叶中的踪迹。

对比对应铜离子（表4）的EPR曲线的强度和自由基曲线（表3）的强度，结果显示这些参数之间没有关联。因此，有关铜离子的出现也许会影响银杏叶中自由基的浓度的猜想还没有被证实。

在欧洲采用银杏叶提取物（EGb761）进行临床应用对症治疗小脑功能障碍退行性痴呆综合征，以及许多体内和体外研究的结果已经支持这种临床应用。淀粉样蛋白beta;的异常产生和聚集肽（Abeta;）和原纤维沉积在脑中被认为是阿尔茨海默病（AD）发病的关键步骤，抑制Abeta;聚集和不稳定预先形成的纤维代表着预防和治疗AD的可行方法。黄酮苷和萜类三内酯（TTLs）是EGb761的两个主要成分分别占总含量的24％和6％。在我们的研究中，从银杏提取物中分离出七种叶片中含量丰富的黄酮苷类（1-7），并通过光谱分析进行表征。而且，建立了超高性能液相色谱法同时定量分析了七种黄酮。这些黄酮的抑制活性，以及四种萜内酯即银杏内酯A，B和C和银杏内酯（化合物8-11）被评估为Abeta;42使用硫代黄素T荧光测定形成的原纤维。发现七种黄酮中三种黄酮1,3和4显示中度抑制活性，而其他四种黄酮2,5,6，以及四种萜类三内酯，表现出较差的活性。 这是第一份关于抑制Abeta;原纤维形成的两种特征酰化黄酮苷6，7在银杏叶中，并根据其结构与活性的关系讨论了黄酮1-7的报告。

老年痴呆症（AD）是老年性痴呆的主要类型，其特征在于一系列病理特征，包括老年斑和神经原纤维缠结的形成。最近多年来，鉴定淀粉样蛋白beta;肽（Abeta;）的报道数量有所增加，原发性病理因素发生于AD，随着平衡的逐渐变化Abeta;产生和清除状态导致聚集的Abeta;的积累。这个积累的Abeta;然后触发一系列复杂的反应，最终导致神经元死亡和认知功能障碍。Abeta;的异常产生和聚集以及脑中原纤维的沉积被认为是AD发病的关键步骤，并以此制定治疗策略。因此，防止Abeta;的聚集或促进原纤维的预成型的不稳定性代表预防和治疗AD的可行方法。

EGb761是目前银杏叶片的标准提取物，由德国和法国的几家公司制造。以证明临床功效为由，EGb761已被德国联邦卫生局批准用于对症治疗脑功能受损痴呆综合征和脑循环系统法国的不足和AD。EGb761主要使用对象为原发性退行性痴呆，血管性痴呆和混合形式的痴呆，其特征在于几个主要症状，包括记忆丧失，集中不良，抑郁，眩晕，耳鸣和头痛。批准EGb761的日剂量为2至3剂量，为120至240mg，通常剂量为建议至少8周。大量体内和体外研究的结果提供了有力的证据支持EGb761的临床应用。黄酮苷（FGs）和三种萜类内酯（TTL）是成分的两大组成，在EGb761中，分别代表EGb761总重量的24％和6％。识别EGb761中的生物活性化合物，我们从EGb和评估它们的抑制活性以及对Abeta;42原纤维的单一化合物的TTLs使用硫代黄素T（Th-T）荧光测定法。使用各种不同的色谱纯化技术，我们分离了七个主要的FG（化合物1-7）EGb，并基于它们的HR-MS，1H-NMR和13C-NMR光谱数据阐明了它们的结构。我们还开发了超高效液相色谱（UPLC）-UV方法用于这些化合物的定量分析，允许量化这七个FG以及提取物和制剂中的四种主要的TTL组分（化合物8-11）。最后，还研究了这些黄酮和萜内酯的活性，在此基础上讨论了这些黄酮1-7的结构-活性关系。从银杏叶提取物中分离出七种类黄酮1-7。HPLC提取物的指纹图显示，这七种化合物占总峰值的54％在HPLC图中观察到的34个峰的面积，回归方程的线性关系，日内和日间精度属性，以及使用我们的UPLC-UV法测定七种分析物的LOD和LOQ值。 如表1所示，对化合物1-7观察到令人满意的线性水平（R2ge;0.999）。 LODs（S / N = 3）和这些分析物的LOQs（S/N = 10）分别小于7.40 mu;g/mL和24.75 mu;g/mL。该表2中列出的结果显示，日内和日间变化小于1.63％（n = 5）和3.65％（n = 5），表明该方法显示出很高的分析所有被测试分析物的精度水平。化合物的重复性值（RSD，n = 5）1-7被确定为小于1.94％，并且恢复研究的结果显示所有七种化合物的平均回收率均在98.1％〜102.8％的范围内全部小于2.08％（n = 7）。 总之，这些结果表明我们的UPLC-UV方法是适合随后对七种黄酮苷定量分析。

在本研究中，我们共收集了11个UPLC-UV分析样品，包括提取物银杏叶的植物性成分，即Tanakanreg;和Ginatonreg;片，由银杏叶提取物。这些样品的细节列在表3中。

对样品S1-11进行UPLC-UV分析以得到化合物1-7的量在这些样品中进行量化。该分析的结果（表4）显示了类似的水平两个商业中存在七个FG，并且非常小的批次间变化存在银杏片Tanakanreg;和Ginatonreg;，反映了制造EGb761和片剂过程中的高水平质量控制。发现了Tanakanreg;中的七个FG的精确水平要比Ginatonreg;高一点。

通过分析四个TTL的曲线确定五种不同浓度的TTL (8-11)线性度标准。结果表示为相关系数（R2）并总结在表5中。

我们使用USP方案进行定量分析的结果表明两种具体的商业银杏Tanakanreg;和Ginatonreg;之间的区别它们包含的TTL数量。例如，Tanakanreg;中有更多的四个TTL而Ginatonreg;中的两种产品均显示出良好的批次TTL重复性。

使用Th-T测定法评价化合物1-11的抑制活性。已经被杨梅素证明具有有效的抗淀粉样变性

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