用于肿瘤递送的基于间充质干细胞的细胞工程与多功能介孔二氧化硅纳米粒子外文翻译资料

 2022-07-25 14:33:29

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用于肿瘤递送的基于间充质干细胞的细胞工程与多功能介孔二氧化硅纳米粒子

摘要

干细胞工程，利用细胞的操作和控制为疾病诊断和治疗带来巨大潜力；然而，在干细胞上赋予多功能化来实现这两者仍然具有挑战性。在这里，我们描述了基于间充质干细胞（MSC，mesenchymal stem cell）的多功能平台，通过整合间充质干细胞的肿瘤靶向传递和介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs，mesoporous silica nanoparticles）的多模态成像优势来靶向原位成胶质细胞瘤。快速的细胞摄取，长的保留时间和颗粒的稳定性证明了MSNs和MSCs的组合作为基于干细胞的多功能平台的潜力。使用这样的平台，通过在原位U87MG胶质母细胞瘤模型的体内多模态成像，我们验证了MSCs的肿瘤靶向传递中肿瘤摄取比没有MSCs的颗粒显示较高。作为一个概念证明，该MSC平台结合干细胞和纳米粒子的优势用于主动靶向传递，为细胞产品的多功能应用开辟了新的视野。

关键词
间充质干细胞（MSCs）； 介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）；细胞工程；多模态成像；靶向传递

1．介绍

在过去几十年中，各种纳米材料为生物医学应用提供了多功能平台，特别是肿瘤的诊断和治疗。然而，一些在肿瘤治疗强大平台上具有突出性质的纳米颗粒（NPs，nanoparticles）由于其不适当的尺寸，形状和/或表面化学性质，显示出较差的对肿瘤的传递和组织渗透。同样的，对普遍的媒介/载体的寻找可以增强潜在的诊断和治疗策略。以前的研究已经证明了间充质干细胞（MSCs，mesenchymal stem cell）作为媒介/平台在靶向传递抗癌剂到肿瘤模型如糖胶质瘤，乳腺癌，结肠直肠癌和黑素瘤的独特的肿瘤趋向特性。基因工程是目前MSCs作为载体进行成像和治疗药物的主要用途。然而，MSC的转导，特别是对于病毒转染，可能导致不想要的转化，显著增加继发性恶性肿瘤的风险。最近，使用NPs的干细胞工程使具有低细胞毒性的靶向传递的简单和可推广策略的发展成为可能，为细胞产品的修饰创造了新的方向。为了提高疾病管理的质量和准确性，多功能化的思想、多重成像和治疗技术的互补优势相结合，近来变得普及。然而，通过直接化学修饰来赋予干细胞产物多功能化仍然是困难的，这受到几个主要因素的限制，例如干细胞对反应环境和细胞组分动态流体的敏感性。此外，基于干细胞的细胞治疗的未来成功，不仅需要良好的干细胞的体内行为控制，而且还需要了解其体内动态命运。各种成像技术已经开发用来跟踪干细胞的体内命运，但每种成像模式都有自己的优势和局限性。然而，到目前为止，将MSCs的靶向传递与NPs的多模态成像结合以构建用于体内全身肿瘤靶向传递的基于MSC的多功能干细胞平台（MSC-平台）仍尚未被查验。

在本报告中，我们介绍了一种将干细胞的肿瘤趋向性和透明质酸基聚合物（HA）包被的MSNs（HA-MSNs）与FITC，NIR染料ZW800，Gd3 和64Cu显像剂相结合的多模态成像的MSC平台，用于光学，磁共振（MR）和正电子发射断层扫描（PET）成像。为构建MSC平台，首先建立了多模态HA-MSN纳米平台。随后，用纳米平台标记MSCs，并研究了MSCs与颗粒的相互作用，包括细胞摄取机制，保留时间，细胞内命运和颗粒的细胞毒性。为了进一步证明体内应用的潜力，原位U87MG胶质母细胞瘤异种移植物被用作探索MSC平台的肿瘤趋向能力的模型。

2.材料和方法

2.1染料掺杂MSNs的制备和表征

通过修改先前的方法合成了60nm染料掺杂的MSNs。简言之，通过用活性染料组合标记3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS，3-aminopropyl triethoxysilane）合成APS染料。例如，分别用FITC（1mg）和ZW800（3mg），在200mu;L含有2％二异丙基乙胺（DIPEA，diisopropylethyalamine）的N，N-二甲基甲酰胺（DMF，N, N -dimethylformamide）溶液中，标记APS（50mg）。将反应混合物在室温下搅拌6小时。将得到的APS-FITC和APS-ZW800混合2小时。分别将十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，cetyltrimethylammonium bromide）（0.27mmol）溶于70mL去离子水中，加入14.29mmol NH3·H2O（28％-30％），在室温下磁力搅拌10分钟。然后在剧烈搅拌下加入一半的正硅酸四乙酯（TEOS，tetroethyl orthosilicate）（0.72mmol）30分钟。加入100 mu;L APS染料，在剧烈搅拌下加入另外一半TEOS ，反应4h。通过离心收集所得颗粒，然后分别用去离子水和乙醇洗涤三次。通过离心步骤完全除去未掺杂的染料。酸性乙醇（40mL乙醇中有1mL浓盐酸）24小时除去CTAB获得MSNs。颗粒用去离子水洗涤三次，然后在4℃下储存。通过透射电子显微镜（TEM，transmission electron microscopy）观察所得颗粒。分别在Genesys 10s 紫外可见分光光度计和F-7000荧光分光光度计（HiTachi，Japan）上记录颗粒的紫外可见光谱和荧光光谱。

2.2用HA基聚合物负载Gd3 和染料掺杂MSNs的表面涂层

为了将Gd3 负载到多孔通道中，将掺杂染料的MSNs与GdCl3一起培养过夜。然后，通过离心收集颗粒，然后用去离子水洗涤三次。

以前的研究报道了HA-CA的合成。在典型的反应中，通过酰胺化将疏水性胆汁酸5beta;-胆酸偶联到水溶性HA聚合物上。首先将5beta;-胆酸转化为5beta;-氨基乙基-胆酰胺（EtCA），并通过EDC和NHS化学过程与透明质酸的羧酸反应。对于HA-CA对MSNs的表面功能化，优化了MSNs与HA-CA的10：1重量比。简言之，将5mg MSNs分散在含有0.5mg HA-CA的1ml PBS中。静置5分钟后，将颗粒聚合在溶液中。然后，使用VCX-750超声波处理器（Sonics＆Materials，Newtown，CT）通过探针超声处理将溶液分散。探头以40％仪器的最大振幅在冰浴中驱动。2分钟超声处理中，颗粒在溶液中充分分散。超声处理后，将溶液分为500mu;L等分试样，并通过一次性PD-10脱盐柱（GE Healthcare）纯化。

2.3 64Cu标记

对于64Cu标记，DOTA-NH2首先将DOTA-NH2在EDC和HOBt存在下通过酰胺化缀合在HA-MSNs上。随后，用64Cu标记HA-MSN-DOTA。通过将0.5mL 0.4 M乙酸铵（NH4Ac，pH 5.5）加入到20 mu;L 64CuCl2中，将64CuCl2转化为Cu(OAc)2。将Cu(OAc)2（1m Ci）加入到HA-MSN-DOTA的溶液中，并恒温搅拌培养1小时。用PD-10柱纯化标记的颗粒以除去未反应的64Cu分子。基于纯化之前和之后的辐射剂量计读数计算标记效率。放射线标记收益率为50％至60％。

2.4 MSCs的制备

遵循我们以前的方案进行MSCs的分离和培养。

简言之，通过颈脱位处死巴勃/ c小鼠。通过将注射器针头（27号）插入骨的一端并用PBS冲洗来收获骨髓。通过70mm尼龙网过滤器过滤骨髓细胞。通过离心收集后，将细胞分散到MesenCultreg; MSC Basal Medium培养基（小鼠）（STEMCELLtrade;技术）（STEMCELLtrade;Technology）（一种用于小鼠间充质干细胞体外培养的基础培养基）中。然后，将细胞在含有95％空气和5％CO 2的潮湿大气中于37℃培养。当粘合细胞达到80％-90％汇合时分裂。在使用MSCs之前，通过FACS证实MSC表面标志物表达谱。对于MSC-fluc的制备，细胞从转染荧光素酶的Balb / c小鼠分离。细胞培养与制备MSCs相同。

2.5颗粒吸收细胞

MSCs在5times;10 3个细胞/ cm 2的密度下在室载玻片中开始实验24小时。与100 mu;g/ mL颗粒培养2 h后，更换新鲜培养基培养2 h。将细胞用Z-固定溶液（Anatech，Battle Creek，MI）固定15分钟。然后，将细胞与0.1％Triton X-100在PBS中室温下一起培养5分钟，随后与用于染色F-肌动蛋白的Alexa Fluorreg;568鬼笔环肽（表达载体）一起培养20分钟，然后在室温下进行1.5mg / ml DAPI染色。观察载玻片并用Olympus共聚焦显微镜（Olympus FV10i）获得3D成像。作为对照实验，使用CellTracker（表达载体）的细胞的标记按照标准方案进行。

通过流式细胞术（FACS）进行细胞摄取的定量分析。将50mu;g/ mL颗粒与MSCs在指定的时间点培养，然后通过洗涤三次除去颗粒。随后，通过离心收集细胞并再分散在PBS缓冲液中。 10000个细胞的荧光强度由FACS进行定量。

对于细胞的保留研究，程序与颗粒的细胞吸收相似。简言之，将颗粒与细胞培养2小时，随后通过PBS洗涤三次移除。通过在指定的时间点改变新鲜培养基来培养细胞，然后用细胞摄取程序进行染色。通过共焦显微镜获得图像。

通过流式细胞术（FACS）进行颗粒保留能力的定量分析。将50 mu;g/ mL颗粒与MSCs培养2小时，然后通过洗涤三次除去。通过添加指定时间点的新鲜培养基继续培养细胞。随后，通过离心收集细胞并再分散在PBS缓冲液中。10 000个细胞的荧光强度由FACS进行定量。

2.6细胞内的命运

MSCs与100mu;g/ mL颗粒在指定的时间点一起培养。收集细胞，除去上清液。将细胞沉淀物固定在含有2％戊二醛和2.5％多聚甲醛的0.1 M PBS溶液中2小时。然后将它们用0.1 M PBS漂洗，嵌入2％琼脂糖凝胶中，在4％四氧化锇溶液中固定1小时，用蒸馏水冲洗，用0.5％乙酸铀酰染色1小时，在乙醇（梯度浓度30％、60％、70％、90％和100％）中脱水，并嵌入环氧树脂中。树脂在60℃下聚合48小时。用超薄切片机获得的超薄切片（50-70nm）用5％乙酸双氧铀和2％柠檬酸铅水溶液染色，并在TEM下成像。

对于颗粒和溶酶体的共定位，将细胞与100mu;g/ mL颗粒在指定的时间点一起培养。细胞用PBS洗涤两次。然后，细胞的溶酶体按照制造商的方案（表达载体 /分子探针），用LysoTracker TM染色。简言之，将细胞与50nM LysoTracker TM一起培养1小时。用PBS洗涤细胞两次，加入新鲜培养基。用奥林巴斯共焦显微镜（Olympus FV10i）观察活细胞成像。

2.7细胞毒性

使用标准MTT测定方案评估HA-MSNs的细胞毒性。简言之，将MSCs与各种浓度的HA-MSNs（0.0625 mg / mL至1mg / mL）一起培养24小时。用200mu;L新鲜培养基（包括20mu;LMTT溶液（5mg / mL））代替培养基，培养4小时。然后除去培养基，并向每个孔中加入150mu;L二甲基亚砜（DMSO）以溶解内化的紫色甲腊晶体。从每个孔中取出100mu;L的等分试样并转移到新鲜的96孔板中。使用酶标仪测量570nm处的吸收。将来自对照细胞的吸收设定为100％细胞活力。

使用荧光素酶作为模型来研究颗粒对蛋白质表达的影响。将MSCs转染的荧光素酶在开始实验前24小时在96孔板中以1times;10 4个细胞/孔的密度铺板。将MSCs与各种浓度的HA-MSNs（0.0625 mg / mL至1mg / mL）培养24小时。用100mu;L新鲜培养基更换培养基。在加入底物D-荧光素（5mu;L 3mg / mL原液/孔）后，使用Xenogen IVIS-100系统（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA）对板中的细胞进行成像。

2.8细胞迁移测定

使用来自制造商（孔径12mu;m，Corning Incorporated）的修改方案测定细胞迁移。用颗粒标记后，将MSCs细胞胰蛋白酶化，并重悬于培养基中。将细胞以2times;104细胞/孔的密度接种在上室中。相同数量的U87MG细胞也接种在下室中。在37℃下培养过夜后，保留在膜上表面的细胞使用拭子除去，迁移到下膜表面的细胞用Z-固定溶液固定并用2％结晶紫染色。计数通过过滤器迁移的细胞数，并绘制为每个视野的迁移细胞数（times;20）。

2.9原位胶质母细胞瘤模型

根据国立卫生研究院临床中心动物保健和使用委员会（NIHCC / ACUC）批准的方案进行原位脑肿瘤模型的开发手术。简而言之，雌性无胸腺裸鼠（4-6周）在右大脑额叶上颅内注射1times;105 U87MG细胞，定位坐标为前囟旁开1.5mm，前0.5mm，深2.5mm。使肿瘤细胞移植3周。肿瘤模型在注射MSCs之前通过MRI证实其成功。

2.10小动物成像

在颗粒标记后，制备3-5代MSCs用于小鼠成像。简言之，将MSCs与50 mu;g/ ml的颗粒一起培养2小时。随后将细胞洗涤两次，然后加入新鲜培养基进一步培养2小时。用颗粒标记后，将MSCs细胞胰蛋白酶化，并重悬于PBS中。用异氟烷麻醉小鼠，皮下注射1times;106个MSCs，以0.1 ml / min的速度尾静脉注射。在指定的时间点

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