酪蛋白水解物-羧甲基壳聚糖偶联物稳定纳米乳液的能力:改善冻融和pH稳定性外文翻译资料

 2022-08-06 09:45:03

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酪蛋白水解物-羧甲基壳聚糖偶联物稳定纳米乳液的能力:改善冻融和pH稳定性

青岛农业大学食品科学与工程学院，地址:青岛市长城路700号，邮编:266109

摘要

以酪蛋白水解物(CHs)和羧甲基壳聚糖(OCC)的偶联物，制备了一种水包油(O/W)纳米乳液，并对其在环境条件下的稳定性进行了评价。在第20天，CHs与OCC的共轭反应更容易，最大糖基化度(DG)为40.7%，褐变指数(BI)为1.47。这一结果通过内源性色氨酸荧光光谱-拷贝和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的偶联物的红移 (350-358nm)得到了证实。透射电子显微镜(TEM)显示，CHs-OCC(0.5-3.0%，w/v)制备的纳米乳粒径较小(227-833nm)，呈球形结构。此外，由于共轭多糖链具有较强的空间效应，所以CHs-OCC纳米乳的稳定性最好;液滴粒径增加从227nm(FRESH、2.5%,w / v)到 427nm(pH值2.0 -7.4在室温下,12 h), 488nm(63 ℃ / 30分钟),389nm(95 C℃/ 10分钟),236nm(0 - 200mM,氯化钠),和255nm(1-15-d存储、4 ℃)。特别是,CHs-OCC大大增强了纳米乳液的冻融稳定性:与酪蛋白相比，3次冻融循环后的粒径分布窄，不表现出双峰（0.1~1mu;m）的现象。在O/W纳米乳液中，CHs-OCC可能是一种天然乳化剂。

关键词

酪蛋白水解物(CHs)；羧甲基壳聚糖(OCC) ；纳米乳液； 偶联物； 稳定性。

1.介绍

纳米乳液是各向同性系统，在食品工业中具有潜在的纳米技术应用。它们由两种不相溶的液体组成，形成直径在20-500nm范围内的液滴(Ren et al.，2019)。水包油（O/W)纳米乳液是各种食品和制药产品的重要组成部分，由于其易于清洗、与水的相溶性好以及在给药系统中的广泛应用，比油包水(W/O)纳米乳液更受欢迎(Pengon, Chinatangkul, Limmatvapirat，amp; Limmatvapirat, 2018)。液滴体积小，提高了液滴积累和重力分离的稳定性。(McClements amp; Rao, 2011)。然而，从热力学角度来看，纳米乳液是不稳定的热力学系统，表现出一些不良的物理化学机制，如乳化、絮凝、聚结、奥斯特瓦尔德成熟和相分离(Dai, Sun, Wei, Mao， amp; Gao, 2018;Xu, Sun，amp; McClements, 2019)。幸运的是，纳米乳液的开发、稳定性和功能可以通过使用合适的乳化剂得到改善。

乳化剂在均匀化过程中快速吸附到油滴表面，从而降低了界面张力，从而促进了液滴的破坏，稳定了纳米乳液。(Bai amp; McClements, 2016)。乳化剂还可以在液滴上形成界面涂层，并产生空间或静电斥力，阻止乳化液滴的聚集(Shu et al.， 2018;Wei et al.，2018a)。各种乳化剂适用于纳米乳液，包括天然乳化剂，如蛋白质、多糖类、皂苷和合成乳化剂，如吐温80 (Shu et al.， 2018;Ozturk。Argin, Ozilgen， amp; McClements, 2014)。目前，对天然产品的需求正在增加。因此，在食品、补充剂、药品、化妆品或农产品的纳米乳液中寻找天然乳化剂来替代目前使用的合成乳化剂是很重要的(Zhu et al.，2019)。

目前在食品纳米乳液中应用最广泛的天然蛋白质乳化剂来自于牛奶，例如酪蛋白，酪蛋白占牛奶总蛋白的80%左右(Ozturk amp; McClements, 2016)。在乳化过程中，乳化剂在界面处重新组装，使其疏水性部分面向油相，亲水部分面向水相(Burger amp; Zhang, 2019)。酪蛋白因其广泛的可得性和理化性质(包括乳化、增稠和凝胶化)而被广泛应用于食品中(Maher, Fenelon, Zhou, Haque， amp; Roos, 2011)。然而，在pH值4.0左右，酪蛋白的净电荷最低，因为它的等电点(pI)为4.6;由此产生的斥力的缺失和伴随的沉淀最终导致酪蛋白乳液的失稳(Su amp; Zhong, 2016)。一种常用的策略是将酪蛋白或其他蛋白质水解成较小的分子，从而提高其弹性和抗菌性、溶解性、抗血栓形成 以及抗高血压的作用(Sarabandi、Mahoonak Hamishekar, Ghorbani, amp;贾法里,2018),以及他们的抗氧化性能(苏amp;钟,2016)。此外，多肽营养丰富，易于消化吸收，过敏性低。这些特性在运动员和家长的婴儿配方奶粉和营养饮食中非常重要(Tirok, Scherze， amp; Muschiolik, 2001)。基于水解蛋白的配方是稳定纳米乳液的材料。Chang, Kang, and Yuan(2018)对水解卵蛋白稳定的O/W纳米乳的研究表明，卵蛋白的适度酸解显著增强其乳化和抗氧化活性(Chang et al.， 2018)。

虽然水解产物增加了界面扩散和乳化能力，但它们在传统的乳液体系中表现出较差的稳定性能，因此不能长期储存(Adjonu, Doran, Torley， amp; Agboola, 2014a)。有研究表明，这可能与溶后空间位阻的减少有关(Drapala, Auty, Mulvihill， amp; Orsquo;mahony, 2016)。

另外，通过美拉德反应，多糖与蛋白质的共价连接被发现在蛋白质功能的修饰中是有用的(Shi et al.， 2019)。Pirestani、Nasirpour、Keramat、Desobry和Jasniewski(2018)研究了通过Maillard反应与阿拉伯树胶结合对菜籽油分离蛋白结构特性的影响，他们的结果证实了糖基化可以减少热量积累(Pir - estani et al.， 2018)。此外，美拉德反应产物增强乳化性能(Kasran, Cui， amp; Goff, 2013)和抗氧化和溶解性(Liu et al.， 2012)的能力已经得到证实。

由于这些优点，美拉德反应产物被推荐用作天然乳化剂和抗氧化剂，并被广泛应用于含O/W乳状液的食品中(Shi et al.， 2019)。然而，大多数以美拉德反应产物为乳化剂的研究使用的是天然蛋白，而不是其水解产物。

本研究的目的是评价酪蛋白水解物(CHs) -羧甲基壳聚糖(cs -OCC) -美拉德偶联物在纳米乳中的乳化效率，为其在食品生产中的潜在应用提供依据。评价了美拉德共轭乳化剂的浓度、冻融条件下的稳定性、不同pH值、不同热处理、不同NaCl处理和储存条件，以确定CHs- OCC美拉德共轭乳化剂作为食品纳米乳乳化剂的潜力。

2.材料和方法

2.1.材料

酪蛋白水解产物(CHs，水解度5%，水6%，灰分7%)购自上海源业生物科技有限公司。酪蛋白,壳聚糖(D.D ge;95%; MW:5 times;105~ 10times;105)，氯乙酸由上海麦柯林生物化学有限公司生产。葵花籽油(SFO)购于中国青岛当地一家超市。无水乙醇、异丙醇、氢氧化钠、盐酸、冰醋酸、溴化钾均产自天津巴斯夫化工有限公司。所有实验中使用的水都用Milli-Q系统进行了纯化(Millipore公司，贝德福德，美国，MA)。2.2.o -羧甲基壳聚糖(OCC)的制备

壳聚糖(5克)溶解在50毫升40%的氢氧化钠溶液内，在IKARET基本热板搅拌器上进行磁搅拌反应(IKA Works，Inc.，Wilmington，NC，USA)30分钟。然后，在30plusmn;0.1°C下将50mL异丙醇缓慢加入上述溶液中进行溶胀。在1h后，将50%（w/v）氯乙酸（溶于异丙醇）溶液的50mL缓慢滴入上述溶液中，在30plusmn;0.1°C下搅拌3h.。然然后，加入100mL95%乙醇终止反应，用冰醋酸调节p H值至pH7.0。随后，收集沉积物并用无水乙醇洗涤三次，以在50plusmn;0.1°C的热空气中获得恒定的重量。最终得到取代度为1.32的OCC (Muzzarell i RAA， amp; iMetal, 1982)。

2.3.CHs - OCC复合物的制备

将CHs (5.0%， w/v)和OCC (5.0%， w/v)分别在4 plusmn;0.1 ℃的磷酸盐缓冲液(PBS; 20毫米，pH 7.4)中溶解过夜。完全溶解的和水合的样品随后在室温下以1：1的质量比在恒定搅拌下混合60分钟，产生具有最终CHS浓度为2.5% (w/v)的溶液(Gu, Abbas, amp; Zhang, 2009; Yang, Cui, Gong, Guo, amp; Hua, 2015)。将混合物冻干，在相对湿度为79%的干燥器中在60plusmn;0.1°C下孵育1、2、3、7、15和20天，然后冷冻干燥，得到的共轭物存储在4plusmn;0.1°C进行后续分析。

2.4.美拉德共轭的表征

2.4.1.糖基化度的测定(DG)

CHs-OCC结合物的DG是根据游离氨基的损失来测定的。CHs-OCC复合物的游离氨基通过邻苯二醛(OPA)法确认(Han et al.， 2019)。

2.4.2.褐变指数(BI)的测定

蛋白质和多糖之间的美拉德反应通常用来测定BI。共轭物在420 nm处的吸光度可以用来确定BI来量化美拉德反应的程度(BI, Yang, Fang, Nishinari， amp; Phillips, 2017)。不同的CHs-OCC共轭物在蛋白质浓度为10mg/mL的纯化水中溶解，并在420nm处测定吸光度。这些实验 一式三份。

2.4.3.本征色氨酸(Trp)荧光光谱法

对在本征Trp荧光光谱测量中，在PBS中，在1mg/mL的水解蛋白下制备CHS、CHs/OCC混合物和CHs-OCC共轭物的溶液。使用F-7000荧光分光光度计(Hitachi Ltd.， Tokyo, Japan)在285 nm激励波长(狭缝宽度为5 nm)下，在300 - 600 nm范围内对发射进行扫描(Pirestani et al.， 2018)。

2.4.4.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)

SDS-PAGE在变性条件下按照之前研究中描述的方法进行(Han et al.， 2019)。

2.5.CHs-OCC复合物稳定的O/W纳米乳的制备

准确称量CHs-OCC偶联物(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g)分别分散于90 mL PBS中，在4plusmn;0.1℃的条件下搅拌3 h。在CHs-OCC偶联物的新鲜水相溶液中，通过均质化SFO制备粗糙的O/W纳米乳液的1:9溶液,每分钟10000转的速度使用高速T25基本搅拌机(IKA Works，Inc.) 10分钟。使用AH Basic高压均质机(ATS Engineering Co.,

Ltd., Vancouver, BC, Canada)进一步均质化粗乳液（均质压力为80MPa，25°C，三次循环）,得到最终的CHs-OCC偶联物在乳液中的浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0%，w/v)。所有乳剂均在4plusmn;0.1°C保存，以便进行后续实验。

用酪蛋白（2.5%，w/v）制备了纳米乳液，并采用相同的方法进行了比较。

2.6.液滴尺寸，多分散性指数(PDI)和zeta电位测量

利用纳米ZS (ZEN 3690) Zetasizer (Malvern Instruments Ltd.， Malvern, UK)对纳米乳液的液滴大小、PDI和zeta电位进行了动态光散射(DLS)分析。用超纯水将乳状液稀释100倍，以保证液滴的布朗运动。每项单独测量一式三份，温度为25plusmn;0.1℃。

2.7.环境胁迫下纳米乳的稳定性评价

2.7.1.冻融处理效果

将用CHs-OCC共轭物（2.5%，w/v）或酪蛋白稳定的新制备的纳米乳液转移到分离的玻璃样品瓶中，并在20plusmn;0.1°C下放置24小时，后来,然后，样品在25plusmn;0.1°C下进行3次解冻2h。在每个循环之后，立即监测纳米乳液颗粒尺寸的变化。

2.7.2.pH值的影响

用0.1 M HCl和0.01 M NaOH将新制备的纳米乳液与CHs- OCC偶联物(2.5%，w/v)或酪蛋白稳定后的pH值调节至不同的pH值(2.0、4.0、6.0和7.4)，室温保存12小时(Wei et al.， 2018b)。然后分别通过肉眼观察和粒度测量来观察宏观形貌和粒度的变化。

2.7.3.热处理效果

对新制备的CHs-OCC纳米乳液（2.5%，w/v）进行各种热处理，即63°C30分钟（巴氏杀菌、低温长时间（L LT）和95°C10分钟（煮沸） 高温短时（H TS T）。然后，立即测量纳米乳颗粒的大小，并获取纳米乳的光学显微镜图像。

2.7.4.氯化钠的影响

在食品加工过程中，食品基质中的离子强度通常会增加。为了分析由CHs-OCC偶联物稳定的纳米乳的耐盐性(2.5%，w/v)，将NaCl溶液分别加入到不同NaCl终浓度为50mm、100mm和200mm的CHs-OCC纳米乳中。30 min后监测纳米乳的粒径变化和zeta电位变化。

2.7.5.贮存稳定性

通过在4plusmn;

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