蔗糖补料策略提高了灵芝发酵过程中生物量、多糖和灵芝酸的产量外文翻译资料

 2022-08-06 11:09:16

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蔗糖补料策略提高了灵芝发酵过程中生物量、多糖和灵芝酸的产量

摘要

灵芝作为一种中国传统医药，有多种生物活性功能。但是，灵芝发酵产量低，工业的生产往往受到限制。本研究发现，蔗糖可显著提高胞内多糖(IPS)含量和胞外多糖(EPS)的比生成速率。通过对多糖生物合成相关酶活性的分析，探讨了其作用机理。结果表明，蔗糖调节了磷酸酶和磷酸葡萄糖异构酶的活性。当葡萄糖和蔗糖混合作为碳源时，生物质、多糖和灵芝酸(气体)的产量大大提高。在10-L生物反应器中建立了蔗糖补料分批策略，并将其推广到300-L生物反应器。生物量、EPS和IPS产量分别为25.5 g/L、2.9 g/L和4.8 g/L，是中试规模最大的生物量和IPS产量。本研究为进一步了解灵芝多糖生物合成的调控机制提供了信息，它论证了蔗糖流加培养有助于提高灵芝的生物量、多糖和灵芝酸产量。

关键词：灵芝；流加培养；发酵；多糖；灵芝酸。

介绍

在中国历史上，灵芝被认为是传奇和文献中不可思议的药物，经现代研究证实具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗炎、保肝、抗艾滋病等作用[1~6]。植物化学研究表明灵芝中最重要的活性成分是多糖和三萜，如灵芝酸[7,8]。目前，灵芝多糖片段上含有beta;-1,3-和1,6-糖苷键，并且由于它们具有免疫调节、抗氧化、抗癌、抗炎等重要的生物学活性，越来越多的人对它们进行了研究[9,10]。

用乳糖和葡萄糖进行培养能获得较高的生物量因而被广泛应用于灵芝发酵[11,13,15]。在灵芝发酵过程中使用蔗糖得到的生物量较低，因而蔗糖不能作为碳源。Tang和Zhong报道，虽然以蔗糖作为碳源适合于EPS的产生，但对细胞生长有很大的抑制作用[13]。多糖的生物合成途径涉及核苷酸糖前体的生物合成途径、重复单糖的组装单位和聚合过程[14]。PGM和UGPP是多糖生物合成中的两种重要酶[12~14]。PGM催化葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1 -磷酸，UGPP催化UDP-D-葡萄糖的合成，UDP-D-葡萄糖是多糖合成中单糖单位的供体[12,13]。通过PGM基因的过表达，可以提高灵芝胞内多糖(IPS)和胞外多糖(EPS)的生成[15]。磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸，也影响多糖的合成，多糖与PGI使用相同的前体[13]。同源UGPP基因的超表达，在灵芝的深层培养条件下，能提高多糖的产量[14]。超表达的UGP基因的灵芝的最大IPS含量和EPS产量分别为24.32 mg/100 mg干重和1.66 g/L，分别比野生型高42%和36%[14]。

流加培养策略有利于发酵过程中产量的提升[11,19]。不同的补糖策略在许多过程中得到发展[17,18]。研究了黑孢块茎的蔗糖补料分批发酵工艺，在其残量降至10-5 g/L时，以蔗糖为食，使其浓度维持在35-5 g/L左右，高效生产具有生物活性的菌丝体和块茎多糖[19]。与分批培养相比，生物量、胞外多糖(EPS)和胞内多糖(IPS)的产量均有所提高[19]。最大生物量为21.89 g/L，最大EPS为0.87 g/L，最大IPS为2.49 g/L，最大产气量为367 mg/L。但在灵芝的发酵过程中，还没有蔗糖补料策略的报道。

本文研究了不同碳源对灵芝发酵过程中生物量、IPS、EPS和产气量的影响。葡萄糖提高了生物量，而蔗糖则大大提高了特定的EPS产量和IPS含量。因此，以葡萄糖和蔗糖混合物为碳源，优化葡萄糖和蔗糖的比例。在最佳工艺条件下，提高了IPS和EPS的产量。对灵芝多糖合成的关键酶进行了研究，探讨了灵芝多糖合成的机理。最后，提出了一种适用于300L生物反应器的加糖策略。

材料与方法

菌株和培养条件

灵芝5.26购自中国通用微生物培养中心;号码是CMCC 5.26。该菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂斜面，并在30℃下培养7天。

种子培养基组成成分（g/L）：葡萄糖35，蛋白胨5，酵母膏2.5，KH2PO4 1, MgSO4 0.26，维生素B1 0.05。第一阶段预培养：先在容量为500毫升的烧瓶中准备90毫升初始PH为5.5的培养基，然后从斜面培养基中接种10毫升菌体悬液；接下来3天在烧瓶上以30℃120rpm的条件旋转培养。第二阶段预培养：在1L烧瓶中准备450毫升培养基，然后接种50毫升一级种子液；接下来2天在烧瓶上以30℃120rpm的条件培养[11,13]。然后，在250毫升烧瓶中加入45毫升初始培养基和5毫升二级种子液。初始培养基由以下成分组成（g/L）：蔗糖45，酵母膏14，KH2PO4 1, MgSO4 0.26，维生素B1 0.05，在30℃120rpm条件下培养12天。

生物量，胞内多糖、胞外多糖和灵芝酸产量的分析

菌丝体从摇瓶培养基中以20 min，10000g的条件进行离心分离，用无菌水洗三次，然后干在60℃下恒重。加入4倍体积95%的乙醇使胞外粗多糖在4℃条件下过夜沉淀。然后，粗多糖在12000g的条件下离心分离5分钟；对于不溶性成分，不溶性组分在60℃1mol /L NaOH中重悬1h，用苯酚-硫酸法测定上清液[11,13,17]。

在对胞内多糖分析时，将50毫克菌丝粉置于1 mol/L NaOH中，60℃悬浮1小时，离心后用苯酚-硫酸法稀释上清测定。在对灵芝酸气体进行分析时，将100毫克菌丝悬于1.5 ml 70% (v/v)乙醇中，超声提取3次;每次30min，离心去除菌丝后，真空50℃对上清进行干燥；用氯仿提取残留成分。用5% (w/v) NaHCO3进一步提取氯仿相中的气体。NaHCO3相的pH值用2mol/L HCl调至3以下。最后用氯仿提取气体，溶解在乙醇中，直至氯仿蒸发。以百里香酚为标准品，在245nm处测定其气体含量[6,11]。

PGI, PGM和UGPP的分析

粗酶提取缓冲液25mM Tris-HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，20mM NH4Cl，0.5mM DTT。5mL液体发酵培养基在8000g下离心分离10分钟。在预冷的灰浆中，用液氮研磨约0.1 g的湿菌丝。将细胞粉转移至1 mL粗酶提取缓冲液预冷的eppendorf管中，在4℃下，以12000 g振动离心10分钟。上清液为粗提液。用Bradford法测定蛋白含量。

采用新鲜制备的细胞提取物，在30℃总容量为1.0 ml的条件下测定PGM和PGI，通过测量340 nm处的吸光度变化来确定NADH的形成或消耗[13,20]。计算了至少三次独立测量结果的平均值。对UGPP的活性进行了分析[21]。

10-L生物反应器的深层发酵

在10-L生物反应器中，用上述方法在烧瓶中制备一级种子液和二级种子液。发酵培养基由以下成分组成（g/L）：葡萄糖25，蔗糖20，酵母膏14，KH2PO4 1, MgSO4 0.26，维生素B1 0.05。用1mol/LH2SO4将培养基的PH调至5.5，然后在121℃下灭菌30分钟。在10L生物反应器中加入6.3L培养基并接种700毫升种子液。为了减少水在生物反应器中的蒸发，在进入生物反应器之前，已灭菌的空气被吹到一个装有无菌水的瓶子里。发酵温度30℃，通气速率7 L/min，搅拌速度300 rpm。

蔗糖流加策略发酵

发酵培养基由以下成分组成（g/L）：葡萄糖25，蔗糖20，酵母膏14，KH2PO4 1, MgSO4 0.26，维生素B1 0.05。用1mol/LH2SO4将培养基的PH调至5.5。在烧瓶中，当剩余糖分别低于20、15、10 g/L时，在超净台的烧瓶中加入5 mL灭菌过的蔗糖(220 g/L)。在10-L生物反应器中，当剩余糖降至15 g/L以下时，将700 mL灭菌后的蔗糖(220 g/L)加入反应器中。通气量为7.7 L/min。

在300L生物反应器中进行中试

在300L生物反应器中，一级和二级种子液在烧瓶上培养。三级种子液：在30L生物反应器中加入18.9L种子液培养基并接种2.1L二级种子液，在30℃下以300rpm10vvm的条件培养24小时。把从30L生物反应器中获得的21L三级种子液转接于300L的生物反应器中，并加入189L发酵培养基。接下来10天内，在30℃下以200rpm1vvm的条件进行发酵。当剩余糖降至15 g/L以下时，将20升灭菌后的蔗糖(220 g/L)加入到300L的生物反应器中，通气量为231 L/min。

结果与讨论

不同的碳源对灵芝菌的生物量、多糖和灵芝酸产量的影响

如表1所示，以葡萄糖为碳源时，得到了最大气体含量、生物量、EPS和产气量。以木糖、蔗糖和半乳糖为碳源的生物量低于10 g/L，明显低于其他碳源。以蔗糖为碳源时，IPS含量最高，且远远高于其他碳源。以蔗糖为碳源的IPS产量最高，但生物量最低。以蔗糖为碳源可获得最高的EPS比产率。葡萄糖和乳糖是很好的碳源。

以葡萄糖和乳糖为碳源时，其生物量、EPS和产气量较好。乳糖和葡萄糖在灵芝发酵中也有广泛的应用[11,13,16]。但蔗糖能显著提高灵芝的IPS含量和EPS的比合成速率，即使生物量较低。在Tang和Zhong的研究中，用蔗糖为碳源大大降低了灵芝菌的生物量，因此他们选择乳糖作为发酵碳源[13]。本研究结果表明，蔗糖促进了多糖的合成，提高了IPS的含量和EPS的比合成速率。

蔗糖通过调节相关酶促进多糖的产生

如图1a所示，在整个发酵过程中以葡萄糖为碳源时，生物量更高。以葡萄糖为碳源时，第8天生物量最高为16.5 g/L，而以蔗糖为碳源时，第12天生物量最高为7.3 g/L，远远低于以葡萄糖为碳源时的生物量。如图1b所示，8天前以蔗糖为碳源时，EPS的产量高于葡萄糖。以葡萄糖为碳源时，第8天以后，EPS的生成迅速增加。最后，在两种条件下，第12天的EPS产量达到了相同的水平。以蔗糖为碳源时，EPS的比合成速率为0.0261 g/(g h)；以葡萄糖为碳源时，EPS的比合成速率为0.0138 g/(g h)。从图1c可以看出，蔗糖作为碳源时，IPS的含量远远高于葡萄糖。蔗糖作为碳源时，IPS的产量也高于葡萄糖。如图1d所示，以蔗糖为碳源时，PGM活性较高。在两种碳源条件下，PGM活性在第10天迅速下降。如图1e所示，葡萄糖作为碳源时，PGI活性更高。以葡萄糖为碳源时，第2天PGI活性最高，第2天之后活性下降。以蔗糖为碳源时，第2天至第6天PGI活性升高，第6天PGI活性最高。如图1f所示，两种碳源条件下UGPP活性水平相似。

如图1所示，以蔗糖为碳源时，IPS含量和QEPS均有所提高，这意味着蔗糖合成多糖的比例高于葡萄糖。以蔗糖为碳源时，PGM活性也增强。唐、钟的研究结果表明，PGM活性与灵芝多糖的产量有关[13]。也有报道称，超表达PGM基因可提高IPS含量和EPS产量[15]。PGM在灵芝多糖的合成中扮演着重要角色，因此以蔗糖为碳源时，更高活性的PGM有利于多糖的产量。PGI是糖酵解途径中的一种酶，与PGM竞争同一底物(葡萄糖- 6磷酸盐)[22]。因此，较高的PGI活性意味着更多的葡萄糖-6-磷酸进入糖酵解途径。本研究结果表明，蔗糖可提高PGM活性，而抑制PGI活性。蔗糖可能通过调节PGM和PGI的活性，使葡萄糖6-磷酸代谢通量从糖酵解途径转变为灵芝多糖的合成。然而，蔗糖是如何调控PGM和PGI活性的还有待进一步研究。

Ji等人研究了UGP基因过表达对胞内多糖(IPS)含量、胞外多糖(EPS)产量以及编码参与多糖生物合成的酶(PGM)、UGP和a-1,3葡聚糖合成酶(GLS)的三个基因的转录水平的影响[14]。UGP基因过表达菌株的IPS含量最高为24.32%，比野生型菌株高42%。UGP基因过表达菌株的最大EPS产量为1.66 g/L，比野生型菌株高36%。结果表明，UGPP在多糖的生物合成中起着重要的作用[14]。然而，本研究结果表明，葡萄糖和蔗糖的情况没有显著差异。

通过优化葡萄糖和蔗糖的比例，提高了生物量、IPS、EPS和气体产量

表1的结果表明，葡萄糖适合于灵芝菌细胞的生长，而蔗糖适合于多糖的合成。为了提高生物量和多糖产量，我们选择葡萄糖和蔗糖混合物作为碳源，优化葡萄糖和蔗糖的比例。如表2所示，当蔗糖的浓度从0增加至20g/L时，EPS、IPS和灵芝酸的产量得到了提高，而生物量变化不显著。当蔗糖浓度从20 g/L增加到45 g/L时，生物量、IPS、EPS和气体的产量大幅下降。当以25g/L葡萄糖和20g/L蔗糖作为混合碳源时，可获得最佳的生物量，EPS、IPS以及灵芝酸的产量。

本研究首先以蔗糖和葡萄糖的混合物为碳源，对灵芝发酵过程进行了研究。从表2可以看出，当葡萄糖浓度从45降至40g/L时，生物量产量并没有下降。但当葡萄糖浓度低于15 g/L时，生物量下降幅度较大。从表S1的结果来看，15 g/L葡萄糖不能支持高生物量生产。但当葡萄糖浓度增加到25 g/L时，灵芝菌生物量增加到11 g/L。

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