多酶系统的策略和观点外文翻译资料

 2022-08-07 14:02:17

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多酶系统的策略和观点

摘要

酶复合物在消除产物抑制，促进中间转移和原位再生辅因子方面具有优势,因此具有实现序列反应高催化效率的潜力。构建能模拟天然多酶复合物的功能性多酶系统对多酶生物合成和无细胞合成生物转化具有极大的好处，但面临许多挑战。当前，已经基于生物大分子如DNA，肽和sc折叠蛋白的相互作用开发了各种组装策略。另一方面，化学诱导的组装是基于酶与小分子（包括抑制剂，辅因子和金属离子）的亲和力，具有简单，点对点结构控制和经济的优势。这篇综述总结了采用这些策略的进展,此外,突出了设计多酶系统的挑战和前景。

关键词

多酶系统；酶组装；化学感应；结构功能分析；设计的生物合成；级联反应

介绍

在自然界中，生物体是具有复杂的包含酶级联反应的多酶复合物，可催化不同代谢途径中的序列反应[1,2]。这些多酶复合物在多步顺序转化过程中显示出优于单个酶的独特优势，例如通过有效转移中间体，促进辅因子再生和消除产物抑制作用来确保高催化效率[3-5]。多酶复合物的有效性取决于它们定义的三级和四级结构，它们是包含多个催化中心的大多数肽[6]。此外，活性位点的紧密接近导致加速反应速率的机械优势，该反应速率可能受到扩散的限制。所谓的底物通道化，即两种或多种酶活性位点之间的中间体通过，也可以避免副反应。这些大分子复合物的结构和反应机理的研究是一个活跃而持续的研究领域，特别是在合成生物学中，其目的是通过设计人工多酶系统来模仿这些生化过程[7]。

与常规的多步化学合成法相比，多酶系统催化的生物合成法也被认为是生产精细化学品和大宗商品的绿色过程[8-11]。综述了多酶合成的一些方面，即多酶系统的共固定化[12-16]，多酶反应系统的总体考虑，例如酶形式的选择，酶反应器和工艺开发[17],用于级联催化的新型多酶系统[18]，以及在合成各种化学品中的应用[19]。尽管多酶系统的共固定化非常吸引人，但由于使用了支持材料或载体，它无法模仿自然进化的多酶系统的精确结构[20,21]，使仿生成为真正的挑战。相反，基于酶与接头而不是载体的相互作用的酶组装具有明显的优势。

本文从酶和接头的选择，用多酶系统开发的结构及其催化效率的提高的角度综述了该策略。深入了解积木设计，可控的装配和还讨论了多酶系统的结构功能分析。最后，考虑了多酶组装的挑战。

基于生物大分子之间相互作用的酶组装

生物大分子框架已广泛应用于酶的组装，可分为三类：DNA，肽和cohension-dockerin蛋白诱导的组装，如图1所示。

DNA

通过互补碱基配对将DNA自组装为一维，二维和三维纳米结构，使DNA生物共轭成为酶自组织的一种有前途的方法[22,23]。预测和控制两种或多种酶的相对位置可以通过设计单独的DNA条带和诱使与DNA条带共价连接的酶的排列来实现[24]。酶可以通过化学结合（例如点击化学反应）附着到DNA条带上[25]。化学共轭需要自然存在或人工突变的表面活性残基。天然发现的具有很强亲和力的酶-DNA结合标签包括生物素-亲和素系统[26]，Halo标签[27]和血红素标签[28]。

DNA-生物共轭可分为两类（图1（a））。一种是无需DNA支架即可直接组装两种DNA标记的酶，这适合于组装两种酶。Erkelenz等[27]报道了细胞色素P450 BM3（CYP102A1）的融合还原酶结构域BMR和卟啉结构域BMP与氯烷烃修饰的寡核苷酸缀合，通过改变DNA长度来调节电子转移效率。第二个是将两种或多种u898888ku标记的酶排列到DNA支架或DNA折纸上，从而可以为多酶系统获得精确的二维或三维结构。Fu等[29]将两个脱氢酶安排在一个DNA支架上，并在酶之间放置了一个携带辅因子的旋转DNA臂，允许反应中间体直接转移。Muller和Niemeyer [euro;30]演示了在互补的DNA载体上进行DNA缀合的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的组装过程，以控制可接近的酶并增强反应性。Shimada等[31]通过DNA支架上基于适体的蛋白质-DNA复合物的结合，提出了三种凝血酶的可控结合。另一个成功的例子是Nojima等人报道了六个绿色荧光蛋白（GFP）-DNA在其互补支架上的精确比对[25]。尽管GFP不是真正的生物催化剂，但是大量生物活性组分的纳米级可控排列技术是非常有吸引力的。DNA-生物缀合的优点是可以精确控制酶的位置，可用于复合物扩散研究。使用RNA scaf折叠，Delebecque等[32]在体外和体内构建了D0（零维），D1（一维）和D2（二维）的精致RNA酶组件。D2 RNA-酶复合物可将氢的产生高度促进48倍，表1列出了基于DNA生物缀合的酶组装实例。

肽

通过使异质酶与肽介导的缀合紧密相近，自然已经发展了有序的级联生物反应[3,36]。结果是已经通过将两种或多种酶融合在一起进行研究，以获得多酶系统[37-39]。

通过基因融合以引入肽接头或通过酶催化的肽交联来产生肽缀合。自从首次应用直接融合的双功能组蛋白醇脱氢酶以来，Youno等人就已经报道了[40]，基于直接融合的各种融合的多酶系统已经获得，具有所需的功能[41,42]。但是酶的直接组装需要肽接头。否则，由于位阻可能会导致折叠错误和失活。

肽接头具有在多酶结构内互连和分离催化结构域的优点。随着分子生物学的发展，已开发出各种方法，例如传统的限制/连接反应，重叠延伸聚合酶链反应（OE-PCR），金门克隆，LE克隆系统和基因合成，通过以下途径组装多酶系统肽接头[43]。

酶的肽生物缀合可以实现具有增强的活性和多功能基团的多酶系统，这在Huang的关于能够整合亲和纯化和活性检测的三重融合蛋白设计的报告中得到了强调[38]。此外，选择合适的肽接头对于分离，避免表面干扰和保持融合亚基的柔性至关重要 Chichili等人综述了选择原理和接头性质[44]，这里不再详细介绍。表2列出了基于肽的酶组装实例。

然而，带有肽接头的融合酶的过表达通常导致包涵体的形成，这不仅损害了酶的活性，而且导致酶的回收率低。例如，由于在大肠杆菌中酶的异源表达，形成不希望的聚集体（称为包涵体），通常会遇到多肽错误折叠，并且这种现象的原因是缺乏翻译后修饰，高细胞内蛋白质浓度[47]和多域酶的多聚[48]。而且在强诱导条件下，例如高诱导剂浓度和温度下，蛋白质错误折叠和聚集的可能性增加。

蛋白质翻译后酶催化的肽交联可以避免此问题。在某些反应性残基对之间共价键的形成是通过被酶催化以获得与多酶系统特异性连接的位点。Heck等人综述了由工具酶如过氧化物酶，酪氨酸酶，漆酶，转谷氨酰胺酶等催化的交联机理，优点和局限性[49]。Chen等[50]还回顾了三种经验肽接头，即挠性接头，刚性接头和可裂解的接头及其优选的应用。对构建用于生物降解的多功能酶复合物的综述也表明，肽接头对每种酶发挥最佳活性的潜力和重要性[51]。

Cohesin-dockerin

Lamed等人首先在热纤梭菌的细胞体系统中发现了用于酶的位置特异性自组装的cohesin-dockerin（Coh-doc）[52]。天然纤维素是一种极其复杂的蛋白质复合物，其中包含具有dockerin域的不同催化亚基，可降解纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶等纤维素底物，并与支架亚基的黏着蛋白模块结合，从而实现良好组织和协同实体[53,54]。有效地降解纤维素，这可以克服纤维素底物的天然抗性[55]。Coh-doc相互作用是一种高亲和力的蛋白-蛋白相互作用，其解离常数范围为10- 9至10 -12M [56]。若使用天然纤维素系统，由于相同物种的dockerins和cohesins相互作用的非特异性结合特征，将导致酶随机掺入支架中，并损害多酶系统的协同作用。然而，来自不同物种的coh-doc对表现出相对较高的位置特异性，只有少数例外，其中非互补的coh-doc对之间的相互作用可能相当大[57,58]。

通常，基于coh-doc的多酶体系的构建策略分为两个类别：（a）一种酶与cohesion融合，另一种酶与相应的dockerins融合。（b）将所有酶与dockerin融合，并将相应的粘连蛋白融合在一起形成chimaeric scaffoldin。前者仅适用于两种酶的组装，而后者可用于构建两种或多种酶的级联反应。表3中列出了基于cohesion-dockerins的酶组装实例。

设计纤维素是cohesion-dockerin系统在生物质降解中的典型用途，Fierobeet等人报道了其首次应用。在2001年，他们展示了一种人造纤维素，其中一些具有两种重组纤维素酶活性，与游离酶混合物相比，纤维素酶显示出增强的协同作用。从那时起，人们投入了很多努力来组装人工设计的纤维素体[60-64]。

除了在生物质降解中的应用外，由于其亲和力强，相互作用小等特点，设计师纤维素系统还用于其他多种酶促工艺中[65]。Chiang等[59]为双酶组装构建了酰胺水解酶-黏附素（AHL-coh）和乙内酰脲酶dockerin（HDT-doc），其反应速率比游离酶高2.6倍。刘等[56]报道了使用三个正交的cohesin-dockerin对在酵母表面上获得级联的多脱氢酶进行甲醇氧化，与游离酶混合物相比，NADH的生产速率提高了5倍。You和Zhang [66]开发了基于coh-doc系统的合成代谢产物，与游离酶混合物相比，其初始反应速率提高了38倍。

但是,与dockerin融合的酶可能会由于空间位阻而导致与scaffoldin分解的问题。Vazana等[67]使用不同长度的模块间支架蛋白接头系统地研究了支架蛋白亚基的空间组织，发现更长的接头更适合于酶复合物的形成。Lee等人综述了基于蛋白质支架或蛋白质壳的其他种类的多酶复合物[68]和Chen和Silver [69]认为而不是表3。表3.基于cohesin-dockerin的多酶组装。酶策略应用参考酰胺水解酶乙内酰脲酶coh-doc组装半合成抗生素生产[59]醇脱氢酶甲醛脱氢酶通过coh-doc反应形成甲壳脱氢酶NADH产生[5]通过coh-doc反应生成磷酸三糖异构酶Aldolase果糖1,6-二磷酸酶Scaffoldin 生产果糖6-磷酸[60]通过coh-doc反应主要由内切葡聚糖酶（CelA），外切葡聚糖酶（CelE）和内切葡聚糖酶（CelG）支架组成的纤维素酶纤维素水解[61]通过coh-doc反应的内切葡聚糖酶celg B-葡糖苷酶bgla支架。磷酸溶胀的纤维素的水解[62]生物技术1027年的重要评论在这里进一步详细讨论。由于在细菌中发展正交系统的优势，微隔室是一种有前途的策略[70]。另一个类似的分隔系统是蛋白质容器[71,72]。在这些主题上有几篇很好的评论[73-75]。

基于化学诱导的酶组装

基于分子和酶的特定相互作用的多酶系统化学诱导剂组装如图2所示。与基于生物大分子的组装相比，它操作简便且成本低廉，是研究细胞事件的有力工具。化学物诱导的蛋白质和酶的自组装主要集中在蛋白质笼和酶复合物的形成上。然而，体外多酶组装的精确控制仍具有挑战性。

抑制剂

抑制剂与酶特异性结合以降低其活性，这取决于其化学结构以及与酶活性位点的相互作用。

同型或异型多价纳米结构可以通过抑制剂诱导形成（图2（a））。抑制剂诱导的酶组装的例子在表4中列出。

通过二聚甲氨蝶呤诱导的二氢叶酸还原酶（DHFR）的受控二聚作用，形成了8至20 nm的酶纳米环，并通过柔性肽接头将酶束缚在一起[79]。周等[78]报道了具有可变长度的融合肽链的DHFR的制备，并且二聚酶抑制剂化学诱导DHFR-组氨酸三联体核苷酸形成大小为10至70nm的蛋白质环。纳米环的催化效率取决于它们的大小，表明酶的超分子组装体的排列可用于控制其催化性能。

已经报道并综述了基于受体-配体相互作用的超分子蛋白质自组装[77,80]。然而，尚未报道使用活化剂组装多酶系统的工作，该系统可能在多酶生物合成中具有潜力[81]。

辅因子

通过辅因子结合的酶亚基分子内组装，已经广泛报道了辅因子依赖性酶，例如氧化还原酶和转移酶[82-85]。

已经报道了基于辅因子与酶的特异性亲和力来选择性固定化酶的方法[86]。诸如NADH诱导的脱氢酶组装等辅助因子可诱导多酶系统的体外组装（图2（b））。辅因子诱导的组装可以形成点对点的定向结构，其优点是易于操作并保持酶的活性。Maring;nsson等[87]使用bis-NADthorn;类似物面对面定位的乳酸脱氢酶（LDH）和醇脱氢酶（ADH），可将NADH的产量从19％提高至50％，表明辅因子优先结合于定位的两种酶的活性位点。但是，NAD 3与酶的相互作用相对较弱。因此，已经开发了便宜且稳定的辅因子类似物。例如，bi-NAD（P）3和bi-NAD（P）3类似物是有希望的用于组装依赖NADH的氧化还原酶的接头，这些酶已被用于手性化学品的生产以及NAD（P）H的再生。表5列出了辅因子诱导的酶组装的例子。

金属离子

金属离子可以诱导蛋白质形成大型装配体，这是基于对金属离子（如天然金属同素蛋白质和金属酶）所协调的非共价相互作用的调节。金属离子通常由位于活性位点的氨基酸残基的氧，氮或硫中心进行配位，从而影响酶的活性和稳定性[89,90]。由于许多蛋白质可以与金属离子结合，因此由金属离子诱导的酶组装是一种很有前途的方法[91–95]。金属离子诱导的蛋白质组装的两种主要类型如图2（c）所示，螯合位点

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