混合效果对L-鸟氨酸分批补料发酵的影响外文翻译资料

 2022-08-07 14:15:25

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混合效果对L-鸟氨酸分批补料发酵的影响

Bio-pilot Plant,rsquo; Microbial and Bioprocess Engineering Laboratory,4 KRIBB, P.O. Box 115, Yusong, Taejon 305-600, Dept. oj Microbial Engineering, Kon Kuk University, Mojindong, Seoul,2 and Yangji Chemical Co. Ltd., Ansan3 442-749, Korea

摘要：研究混合效果对用L-精氨酸营养突变体ATCC 21092的短杆菌酮谷氨酰胺短杆菌发酵生产L-鸟氨酸的影响。在7L发酵罐中，研究了三种不同类型叶轮的分批补料培养方式。前两种是采用六直叶片圆盘涡轮叶轮的发酵罐分别从顶部和底部进料。第三种是采用六弯叶片圆盘涡轮叶轮发酵罐并从顶部进料。与采用顶部进料的六直叶片涡轮叶轮相比，采用底部进料或采用六弯叶片圆盘涡轮叶轮时，L-鸟氨酸的产量提高了1.8倍。结论发现，不同的进料和搅拌方式对有限培养基的混合时间有显著地改变。尽管三种不同培养方式下的CO2变化、氧和葡萄糖摄取速率曲线图非常相似，它能合理解释不同培养方式下微生物的生长速率十分相近。然而，发现三种培养方式生产氨基酸具有不同的活性。结果表明，通过缩短发酵罐中有限营养物质的混合时间，可以显著提高L-鸟氨酸的产量。

关键词：L-鸟氨酸 补料分批发酵 混合效果 放大

  1. 鸟氨酸是精氨酸生物合成的中间代谢物,有效治疗肝脏疾病,帮助促进心脏的作用[1]。因此,它拥有庞大的世界市场[2]，Kinoshita等人在1957年首次报道了使用L-瓜氨酸或L-精氨酸需要突变体的谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-鸟氨酸[3]，他们还报道在有限的L-精氨酸供应下，葡萄糖的摩尔产量高达36%。L-精氨酸和L-鸟氨酸的生物合成途径和调控机制在大肠杆菌[4]和棒状杆菌[5]-[10]中得到了广泛的研究。L-鸟氨酸生物合成的关键酶是N-乙酰谷氨酰胺激酶，它被L-精氨酸明显抑制[10]。因此，L-精氨酸的残留浓度应谨慎控制在低水平，以获得高的鸟氨酸产量。此外，微生物的增长率需要维持在一个最佳范围内，因为L-鸟氨酸的产量高度依赖于增长率[11]。

本课题组之前报道，当L-精氨酸连续供应时，L-鸟氨酸的产出率是没有供应L-精氨酸时的1.6倍[11]。这一结果再次证实了控制L-精氨酸浓度对生产L-鸟氨酸的重要性。然而，在具有相同放大参数(KLa、功率等)的大型发酵罐中，5L发酵罐中L-鸟氨酸的最终产量无法达到。此外，观察到L-鸟氨酸的产量高度依赖于发酵罐的几何形状。根据这些观察结果，我们认为发酵罐内的非均匀混合可能是造成放大困难的主要原因之一。因此，我们研究了混合性能对L-鸟氨酸发酵放大的影响。

描述混合的方法有很多，它们可以大致分为刺激/响应技术、流速和局部速度测量[12]。最简单的方法之一是使用示踪材料脉冲的刺激/响应方法来测量混合时间[13]。示踪剂在反应器中的分布由一个或多个传感器记录，混合时间通过测量所需的时间来确定，以达到特定的混合程度的反应堆。利用该技术确定了发酵罐内的混合时间，并对混合效果进行了评价。本报道通过改变叶轮类型或补料方式显著提高了L-鸟氨酸的收率。结果还表明，混合时间是L-鸟氨酸发酵系统中最重要的放大因素之一。

1 材料和方法

微生物：本研究所用的微生物为短杆菌酮谷氨酰胺短杆菌的L-精氨酸营养突变体ATCC 21092。我们在之前的报告[11]中已经详细介绍了这种生长营养菌株的特性。

配方：所含种子培养基(gbull;L-1）；葡萄糖20，酵母提取物10，细菌蛋白胨10， NaCl 5和K2HP04 5，用于初始种子培养。

培养基为(gbull;L-1)；60葡萄糖，5酵母提取物，0.3 MgS04.7H20，0.8 KH2P04，1 Na2HP04 bull;12H20， 4 (NH4)2S04 和1mlbull;L-1的微量元素溶液，其中1/1N HCL包括：13.2 g CaCl·2H20， 8.4g FeS04·7H20，2.4g MnS04·4H20，2.4g ZnS04·7H20，0.48g CuS04·5H2O，0.48g CoC12·6H20，0.24g Na2MoO4·2H20和0.06g K2B407·XH20。

补料培养基：葡萄糖660g，酵母提取物12 g， 66g(NH4)2S04，3g MgS04.7H20，L-精氨酸2.8g， 12g Na2HP04·12H2O和4.5g KH2P04每升蒸馏水。

培养条件：培养于营养琼脂培养基(牛肉提取物3gbull;L-1、蛋白胨3gbull;L-1和琼脂20gbull;L-1)上，培养48 h，培养温度30℃，将细胞接种于两个1L型瓶，其中包含150 ml种子培养基。在旋转振动筛(160rpm)上30℃培养12小时后，将种子培养液转移到含有2.7L培养基的7L发酵罐。连续添加饲料培养基3 h开始补料分批培养。温度维持在30℃，pH控制在7.0,25% NH40H。曝气速率固定在1vvm。搅拌速度控制在溶解氧饱和度20%以上。

分析方法：使用分光光度计(Uvicon 941Plus,瑞士)在600nm处测量光密度，监测细胞生长。使用YSI葡萄糖分析仪(YSI 2000,USA)测量葡萄糖浓度。用热量法测定L-鸟氨酸浓度[14]。使用02-CO2分析仪对尾气进行分析。

发酵罐几何结构:本研究使用的发酵罐(KFC 7L,Korea)直径为150 mm，高度为400mm，如图1所示。它有一个顶部驱动系统，有三个叶轮，最低的叶轮放置在距底部30mm的距离。顶部和中部叶轮分别固定在距最低叶轮190mm和95 mm处。火花机被放置在最低的叶轮下面，有一个孔朝上。本研究采用了两种不同类型的叶轮，一种是直叶片叶轮，另一种是30°弯叶片叶轮。叶轮直径为72mm，平板叶片尺寸为12times;18mm。发酵罐有四个挡板，大小为15x280mm。补料进给口安装在上盖距中心轴60mm处(图1)，取样口安装在下叶轮段。因此，所测得的细胞OD值、葡萄糖和L-鸟氨酸的浓度是样品所在的底部叶轮区域的局部值。

图1 L-鸟氨酸发酵的发酵罐几何形状。文中给出了发酵罐几何结构的详细描述。

混合时间的确定：发酵罐系统的混合性能是通过测量所需的混合时间，以达到特定程度的混合反应器。混合时间的测量是由注入10ml·5 N-1氢氧化钠溶液包含发酵罐的蒸馏水和溴甲酚紫80 mg·L-1,和由此产生的光反射率的变化测量随着时间的推移,通过光电传感器和一个积分器。光敏元件安装在距发酵罐底部60mm和260mm的发酵罐外部。在不同搅拌速度和1 vvm的固定曝气率下获得90%的混合所需时间为混合时间。在发酵罐上盖上两孔的纸(直径20mm)作为光源和感光器。光源方面，在距发酵罐100mm处放置一个20瓦的卤素灯作为光源。

2 结果

轴向循环时间是径向循环时间的5-10倍[15]。这意味着给料介质到达三个叶轮段所需要的时间是不同的。因此，如图2C所示，在叶轮各截面采用直叶片圆盘涡轮叶轮或弯叶片圆盘涡轮叶轮，检查混合时间。这张图显示了一个典型的分批实验的结果，用于确定顶部和底部叶轮截面的混合时间。搅拌速度对搅拌时间的影响在上叶轮段约为l-3s。在底部叶轮部分，带有直叶片圆盘涡轮叶轮的发酵罐搅拌需要7-12s，而带有弯叶片圆盘涡轮叶轮的发酵罐只需3-6s。

图2 发酵罐不同类型叶轮的混合型能。文中对所使用的方法作了详细的说明。(A)六直叶片圆盘涡轮叶轮发泡器中上下叶轮段混合时间(B)六弯叶片圆盘涡轮叶轮(C)不同搅拌速度下的混合时间。

2.1六直叶片圆盘涡轮叶轮顶部分批补料培养

图3显示了在平板式叶轮和顶部进料的发酵罐中进行的补料分批培养的结果。接种后，细胞在前9h内生长迅速，在40h后仍保持稳定。随着饲料培养基的上投，L-鸟氨酸开始积累，24 h浓度达到28g/L, 48h达到42g·L-1，培养物中未见进一步增加。结果表明，葡萄糖残留浓度在L-鸟氨酸生产阶段先下降到6g·L-1，而随着L-鸟氨酸生产速率的下降，葡萄糖残留浓度又上升。

通过分析尾气，监测L-鸟氨酸产菌的代谢活动变化(图3)。在早期阶段，氧气的吸收率（OAR）和二氧化碳转化速率(CER)在前12h内迅速增加。在第二阶段，二者均略有增加，这与L-鸟氨酸产量高有关。在第三阶段，随着L-鸟氨酸产量的降低，二者显著增加。在第四阶段，氧气的吸收率，二氧化碳转化速率和L-鸟氨酸产量没有进一步增加。在第三阶段，L-鸟氨酸的产量下降，而氧气的吸收率和转换率明显增加。需要注意的是，随着培养体积的增大，第三阶段对应的是上叶轮开始接触培养液的时间。这说明随着搅拌时间的增加，L-精氨酸在叶轮上段逐渐积累，在叶轮下段逐渐耗竭，从而导致了L-鸟氨酸产率的下降。在仅配备了一组叶轮的5L发酵罐中没有观察到这一点(数据未显示)。因此，如果低生产率主要是由于中间和底部叶轮段搅拌不均匀造成的，可以通过改进轴向搅拌的变距型叶轮来解决这一问题。

图3采用六直叶片圆盘涡轮叶轮和顶部进料的补料分批培养法生产L-鸟氨酸-盐酸。

细胞生长(○)，D-葡萄糖(■)和L-鸟氨酸-盐酸(□)

2.2六弯叶片圆盘涡轮叶轮补料分批培养

使用弯叶片圆盘涡轮叶轮时，菌体生长模式与使用直叶片圆盘涡轮叶轮时相似，但L-鸟氨酸的产量明显增加(图4)。L-鸟氨酸的产生开始于6h，并在培养30h后急剧增加至30g·L-1。然后，在持续约5h的轻微滞后期之后，它又迅速增加到74g·L-1。

对于弯叶片叶轮，OAR和CER在培养的前10h内呈线性增加，直到30h后几乎保持不变，此后再次线性增加，分别为每小时100 mmol·L-1和160 mmol·L-1(图4)。

与直叶片叶轮相比，在菌体生长速率相近的情况下，使用弯叶片叶轮时L-鸟氨酸的产量明显增加。此外，在弯叶片圆盘涡轮叶轮的培养中，残留葡萄糖的浓度维持在一个较低的水平，而在直叶片圆盘涡轮叶轮的培养中，残留葡萄糖的浓度不断累积。这些结果表明，限制养分的有效利用显著提高了微生物产生L-鸟氨酸的活性。即使在培养的后期也能保持较高的生产率，这主要是由于采用了弯叶片圆盘涡轮叶轮提高了混合性能。

图4 采用六弯叶片圆盘涡轮叶轮和顶部进料的补料分批培养法生产L-鸟氨酸-盐酸。

细胞生长(○)，D-葡萄糖(■)和L-鸟氨酸-盐酸(□)

2.3底部分批补料培养

为了提高限制养分的有效性，进行了一种补料分批培养模式。通过在发酵罐底部装有直叶片叶轮的曝气口进行底部进料。如图5所示，接种后15h内细胞呈指数增长。之后观察到较低的细胞生长速率。从此时开始，L-鸟氨酸的产量开始缓慢增加，最终在57 h时,L-鸟氨酸的浓度为72g·L-1。在L-鸟氨酸的生产阶段，葡萄糖的残留浓度下降到0.5g·L-1。应该注意的是,在培养早期阶段的OAR和CER与在顶部给料时类似(图5)。这些结果表明，即使在培养的后期，通过增加限制养分的有效性，也可以保持L-鸟氨酸的高产量。

图5 采用六直叶片圆盘涡轮叶轮和底部进料的资料编号：[245939]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

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