微反应器中漆酶催化左旋多巴氧化的建模外文翻译资料

 2022-08-07 14:33:47

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微反应器中漆酶催化左旋多巴氧化的建模

关键词：

多巴 漆酶 氧化 微反应器 反应扩散动力学 建模

摘要：

在y型微反应器中，在不同的停留时间下，研究了在氧饱和水溶液中漆酶催化的1-DOPA氧化。在给定的微反应器几何形状下，在低于2分钟的停留时间下可实现高达87％的lDOPA转化率。建立了由对流，扩散和酶反应项组成的二维数学模型。用双重底物Michaelis-Menten方程描述了酶的动力学，其中使用了先前进行的批量实验的动力学参数。通过在微反应器中进行的一组实验证明并验证了通过复方程系统的非等距有限差分数值解获得的模型模拟。基于开发的模型，进一步的微反应器设计和工艺优化是可行的。

  1. 介绍

漆酶（EC 1.10.3.2，对二苯酚：双氧氧化还原酶）目前被视为工业氧化反应中非常有趣的酶，因为它们能够氧化多种底物[1–3].。由于酶促反应比传统化学过程具有许多优势，因此它们代表了经济和环境优化工业过程的巨大潜力[4]。

微反应技术在包括化学和生物化学在内的广泛领域中正变得越来越重要。现在很明显，在正确的条件下，微反应器可以提供更好的选择性，更高的产率，更高的工艺控制，更高的安全性，更快的放大规模，灵活的生产以及利用先前避免或新颖的化学方法的机会。由于所需的化学品量少，并且传热和传质速率高，因此微反应器还是用于快速筛选（生物）催化剂的极其有效的工具[5,6]。主要开发使用溶解或固定化酶的酶促微反应器，以改善蛋白质组学和遗传材料生化分析的常规工作[7,8]。尽管酶微反应器具有引入工业规模合成的潜力，但在该领域尚未开发出许多专利。微型反应器数量最多的专利在有机化学领域（454项专利），而生物化学，啤酒，烈酒和葡萄酒技术以及微生物学领域的专利几乎减少了两倍（共265项专利）[9]。此外，迄今为止尚未公开酶微反应器的数学模型，其包括流量分布，转运现象和酶反应动力学，从而能够描述和优化工艺。Maruyama等人报道了由漆酶催化的对氯苯酚降解的简化模型，这也是关于微通道装置中两相流中酶促反应的第一个报道[10]。为了更好地理解微反应器中的酶促氧化过程，以漆酶催化的3,4-二羟基-1-苯丙氨酸（L-DOPA）氧化为模型过程。L-DOPA是在水中低溶解度的酚类化合物的代表。它是一种天然饮食氨基酸，是多种代谢途径的中间体，是所有儿茶酚胺神经递质和激素以及黑色素的前体[11]。漆酶催化的L-DOPA氧化的第一步产物是多巴醌[12,13]。 醌是高反应性化合物，可以自发聚合形成高分子量化合物，例如黑色素，或与氨基酸和蛋白质反应，这些蛋白质和蛋白质通过酪氨酸酶的作用增强植物产生的棕色[14]。 在微反应器中研究了漆酶催化的L-DOPA氧化，该反应器有两个以不同体积流量流入的反应器。建立了由对流，扩散和酶反应项组成的二维数学模型。

2.理论背景

2.1微通道中的速度分布

如一些文献报道所述，层流表征了微反应器的流动条件[5–10,15]。为了模拟微反应器中的L-DOPA氧化，首先建立了速度分布图。

如图所示图1a主微通道由两个水相进料供给：漆酶的氧饱和或半饱和水溶液和L-DOPA的氧饱和或半饱和水溶液。由于两个流入相具有相同的粘度，并且以相同的流速泵入系统，因此它们都占据通道的相同部分。抛物线速度分布的假设仅在最小的z维度上发展，因此由于我们实验中使用的微通道的宽/高比较小，因此不可能在y方向上均匀地分布速度分布：1（图1b).因此，考虑到水相的稳态流而忽略了可压缩性和重力，开发了一种Poiseuille型流。

以及相关的边界条件

其中无量纲自变量定义为= x / W，= y / W，omega;= z / W，x，y和z分别是通道长度，宽度和高度方向上的坐标；H和W代表微通道的高度和半宽度（m）；v是水的x方向速度（m / s），1Jw是水的动态粘度（kg / ms）。沿微通道的长度L施加恒定的压力梯度，因此方程式中的part;P 简化为P / L[15]。

2.2.漆酶催化的L-DOPA氧化在微通道中的反应扩散动力学

为了描述和预测微反应器的性能，开发了一个二维模型，该模型考虑了流动（x）方向上的对流和两个方向（x和y方向上的扩散）图1。具有关联边界条件的单程微反应器系统中稳态条件的无因次偏微分方程如下：对于L-DOPA（LD）：

其中相关的边界条件

对于，氧气

其中边界条件

对于漆酶

其中边界条件

其中，Cld,Co2,Ce代表浓度，D LD/W,D O2/W,D E/W分别表示1-DOPA，氧气和漆酶在水中的扩散系数；ci表示入口浓度，v是水的x方向速度（m/s），Vm是最大反应速率,而Kld和Ko2是L-DOPA和氧气。

2.3.扩散系数的估计

用于估计lDOPA在水中的分子扩散系数（D ），则使用 Scheibel经验相关性[17]

其中V LD和V w（m3 /mol）分别是1-DOPA和水的摩尔体积，1Jw是水 动力粘度（kg / ms），T是温度（K）,用于估计分子扩散 L-DOPA的时间为7.3分钟。 使用血氧仪（WTW pH / Oxi 340，电极WTW Cellox 325，德国 魏因海姆）测量溶解氧浓度。 用于估计分子扩散水中氧气系数DO2/w，我们使用了斯托克斯-爱因斯坦方程[18]

而漆酶在水中的分子扩散系数（DE/w）取自文献[19]

3.数值分析

使用二维笛卡尔网格上的有限差分来替换所提出的模型方程中的偏导数。静态等距有限差分转换为非等距有限差分。为了解决模型方程的复杂非线性系统，开发了Mathematica 5.2代码，该代码可以快速收敛到解决方案[15].4. 实验4.1. 用料4.1.1. 化学制品 l-DOPA和（NH4）2SO4购自Fluka AG（德国斯坦海姆），Na2HPO4，KH2PO4和高氯酸购自Merck （德国达姆施塔特（Darmstadt））和HCl购自Kemika（克罗地亚萨格勒布）。

4.1.2.酶Trametes.versicolor的漆酶购自Fluka AG（瑞士布克斯）。

4.2. 方法

4.2.1. 在微反应器中漆酶催化的L-DOPA氧化

漆酶催化的l-DOPA氧化反应在玻璃中进行具有y形流入和流出通道的微反应器主通道的尺寸为：宽度220 micro;m，高度50 micro;m和长度332 mm （Micronit Microfluidics BV，荷兰恩斯赫德）。氧饱和度（ci,O2 = 1.15 mM） 或半饱和（ci,O2 从一次进料中加入0.28mol / L磷酸盐 缓冲液（pH 5.4）中的0.58 mM）1-DOPA溶液 0.2 mol / L磷酸盐中的饱和或半饱和漆酶溶液 缓冲液（pH 5.4）由y形微型反应器的另一次进料（图。1）。入口处使用不同浓度的l-DOPA：ci,LD = 0.5、3或5 mM，而酶浓度入口保持恒定ci,E 0.2 mg/mL.两个注射泵 （PHD 4400注射泵系列，哈佛仪器，美国Holliston）用于溶液供应。 两种溶液都在 和D2 相等且恒定的流速为100、10、5或1 micro;L / min，因此微型反应器中的总流速为200、20、10或2 micro;L / min。在进行HPLC 分析之前，将微反应器的样品稀释在0.1 mol / L HCl中。

4.2.2. 分析工具

用HPLC（Knauer，Berlin，Germany）在30◦C下用反相C18C18125 mm 4 mm 5 micro;m反相液相色谱法评估微反应器样品中l-DOPA的浓度， 并用0.1 mol / L HCl稀释。色谱柱（LiChrospherreg;100，默克， 达姆施塔特，德国）和UV在280 nm处检测。使用的流动相是水， 加入高氯酸直至达到pH 2.10–2.15，并以0.7 mL / min的流速进行样 品洗脱[16]. 用盐酸（0.1 mol / L）稀释用于校准曲线的l-DOPA标准 品和从反应器中取出的样品。保留1-DOPA的时间为7.3分钟。 使用血氧仪（WTW pH / Oxi 340，电极WTW Cellox 325，德国 魏因海姆）测量溶解氧浓度。集中在反应介质中。

5.结果与讨论

5.1微通道中的流体流动

为了观察微通道装置内的流体流动，将普通水和有色水分别以相同的流速注入。微观观察，在图2 对于我们的研究中所使用的流速（波纹管200 micro;L / min），证实了平行于通道侧壁的层流。此外，界面的位置恰好在通道的中间，这再次证实了我们对模型的假设（图2）。

使用模型方程，对微通道中的流体流动进行二维数值模拟，其界面区域位于通道中间。等式(1)和(2), 揭示了在稳态条件下，微通道开始后不久就发生了完全展开的轮廓（图3）。这使我们能够考虑一个完整开发的速度分布，图3b，在整个微通道内浓度分布的进一步模拟中。5.2. 模型参数估计根据方程式(9)和（10）计算I-DOPA和氧气在25℃下在水中的扩散系数。左旋多巴的扩散系数为 0.436times;10m2/ s和DO /w= 2.31times;10minus;9m2/ s，而漆酶在水中的扩散系数DE/w= 3.6 10minus;11平方米/秒摘自文献[19]. 漆酶催化的l-DOPA氧化的动力学参数，先前在间歇反应器中估算[16], 用于酶反应的数学建模在微通道内：Vm= 6.897 U / mg，Kld= 0.469 mM和Kmo2=0.099mM.

5.3. 微通道中的酶反应

漆酶催化的l-DOPA氧化的实验结果总结如下：在微型反应器中的稳态条件下，以不同的进口l-DOPA和氧气浓度以及不同的流体流速进行表格1.在氧气饱和的介质中，最低的入口l-DOPA浓度为0.5 mM时，l-DOPA的转化率高达87％（ci,O21.15 mM），最长停留时间为110 s（总流体流速˚= 2 micro;L / min）。如所预期的，在氧饱和的介质中以较高的1-DOPA浓度（ci,LD= 3或5 mM）和较高的流速，从而缩短了停留时间，在所选的微反应器中获得了足够低的转化率。氧气浓度降低一半时，转化率明显降低（ci,O20.58 mM）与氧饱和的0.5 mM 1-DOPA溶液相比，这证实了氧对生物转化的影响-准确率。在测试的最高流体流速下（˚= 200 micro;L / min，r = 1.1 s），对于任何测试的反应条件，我们都未观察到微通道内的任何转化。此外，当使用两种底物的最高浓度时，在停留时间长达22 s时都没有发生生物转化。与具有连续曝气的理想混合半间歇反应器的结果进行比较，证实了微反应器技术优于经典反应器的优势，传统反应器在4分钟后达到了相同的1-DOPA转化率（初始浓度为0.5 mM）。但是，只有在经过充分搅动和大量喷射的实验室规模的容器（烧杯）中连续供应纯氧，才能实现如此高的转化率，从而提供最佳的质量传输[16]. 此外，使用固定化酶进行连续过程操作甚至可以改善集成微结构器件的过程经济性。为了分析实验结果并预测微反应器性能，对数学模型进行了仿真。使用等式执行。(3)–(8), 考虑充分发展以及微流的层流性质。基于先前在批处理实验中确定的动力学参数，对数学模型仿真的结果进行比较[16] 实验数据在图4。可以看出，在微反应器中进行的l-DOPA的实验转化与所有进口的l-DOPA和氧气浓度以及所有施加的流量的模型预测都非常吻合。

5.4. 微通道内的浓度曲线

通过基于先前描述的速度分布和双底物的偏微分方程非线性系统的数值解获得了主微通道内特定组分的浓度分布Michaelis–Menten动力学模型（方程(1)–(10)). 在最低测试总流速为2 micro;L / min的情况下，在微饱和反应器中，在氧气饱和的水溶液中进口l-DOPA浓度为0.5 mM时，沿着微型反应器的l-DOPA，氧气和酶浓度的结果显示在图5。从中可以明显看出图5a，酚醛底物容易扩散到另一半水溶液中，并以整个通道的大约三分之一的通道长度均匀地分布在整个微通道中。从下图还可以看出，由于沿微通道的酶促反应，导致1-DOPA浓度降低。图5a.在两个入口处以相同浓度（ci,O21.15 mM）供给作为第二氧化基质的氧气，并沿微通道消耗（图5b).从两个图中都可以看出，1-DOPA几乎沿着通道耗尽，而氧气以冗余的形式存在。两种反应物在这些操作条件下均无法完全反应的原因可能是漆酶在水中的低分子扩散性和较短的停留时间，从而阻止了酶完全扩散到水溶液的另一部分，从模拟中可以明显看出沿微通道的漆酶浓度分布图图5c。相同的解释也可以用于解释在较高的入口浓度和较短的停留时间下I-DOPA氧化的不良结果，这表明使用更长或更连续的微反应器。

6.结论

本文在微反应器中进行了T.versicolor漆酶催化左旋多巴氧化的研究。在100s的停留时间下，0.5 mM的左旋多巴达到87％的高转化率。对于较高的底物入口浓度，在相同的操作条件下，同一微反应器中的氧化效率较低，部分原因是漆酶在水中的分子扩散性较低，因此通道中某些部分的酶浓度不足，这建议使用更长的微通道。基于已开发的与实验数据和酶固定化非常吻合的模型仿真，进一步的微反应器设计和工艺优化是可行的。参考文献[1] AM Mayer，RC Staples，漆酶：旧酶的新功能，Phytochemistry 60（2002）551–565。[2] SG Burton，漆酶和有机合成中的酚氧化酶—综述，Curr。单位化学7（2003） 1317-1331。[3] S.Rodriacute;guesCuoto，

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