斑马鱼转基因品系huORFZ 是检测环境有毒物质的有效生物指示剂外文翻译资料

 2022-08-07 15:00:44

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斑马鱼转基因品系huORFZ 是检测环境有毒物质的有效生物指示剂

李洪杰1 。，蒲念年1,2 。，黄慧兰1,2 。，朱千 3,4，李红萍 3，蔡怀仁1 *

1国立台湾大学分子与细胞生物学研究所，台湾台北，2台湾肝病防治研究基金会，台湾台北，3台湾农业化学与有毒物质研究所农业委员会，“行政院”，台湾台中，4土壤与土壤系

国立中兴大学环境科学系，台湾台中

摘要可靠的动物模型对于监测水生环境的污染程度具有不可估量的价值。在这项研究中，我们证实了一种新的转基因斑马鱼品系huORFZ的潜力，因为该品系含有一个与GFP报告基因融合的chop基因人类上游开放阅读框，从而可作为监测环境污染物和相关细胞应激过程的动物模型。当huORFZ胚胎在正常状态下，无法检测到泄漏的GFP信号。当用危险化学物质（包括接近其半数致死浓度（LC50）的重金属和内分泌干扰物）处理时，huORFZ胚胎表现出不同组织特异性的GFP表达模式。为了进一步分析，采用了铜（Cu 2 ），镉（Cd 2 ）和毒死蜱进行验证。Cu 2 触发皮肤和肌肉中的GFP反应，而Cd 2 这种处理触发了皮肤，嗅觉上皮组织和前肾导管中的GFP反应。此外，huORFZ胚胎所表现出的荧光强度存在剂量依赖性。在存活的经过处理的胚胎恢复到正常状态后，其存活率以及原位末端标记信号恢复到预处理水平，没有观察到明显的形态缺陷。这些结果表明在胚胎存活的情况下，本研究中运用到的处理条件是具有可逆性的。值得注意的是，GFP信号随着胚胎的恢复而减弱，这表明huORFZ胚胎的GFP信号总体上反映了每个个体的生理状态。为了检验huORFZ品系在实际条件下的表现，我们将huORFZ胚胎放置在不同的河水样本中。我们发现huORFZ胚胎正确地检测到了各种污染物的存在。根据这些发现，我们得出这样的结论：这种基于uORFchop的系统可以集成到一线的污水报警系统中，用以监控有害污染物的排放。

引用：Lee HC，Lu PN，Huang HL，Chu C，Li HP等。（2014）斑马鱼转基因品系huORFZ是一种有效的生物指示剂，可检测环境毒物。公共服务9（3）：e90160。doi：10.1371 / journal.pone.0090160

编辑：Christoph Winkler，新加坡国立大学，新加坡

2013年10月18日收到；2014年1月27日接受；2014年3月3日发布

版权所有： 2014 Lee等。这是根据知识共享署名许可协议的条款分发的开放获取文章，该文章允许在任何方式下不受限制地使用，分发和复制，但要注明原始作者和出处。

资金：这项工作得到了台湾国家科学委员会（http://web1.nsc.gov.tw/mp.aspx?mp = 7）的支持，资助号为NSC -01-2321-B-002018-。该研究还得到台湾台北市肝病预防与处理研究基金会的部分支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿中没有任何作用。

竞争利益：作者宣称不存在竞争利益。

*电子邮件：hjtsai@ntu.edu.tw

。这些作者同等贡献这项工作。

介绍

在危及到水生环境的威胁中，工业和生活废水的排放对淡水生态系统以及农业生产和人类健康的影响最大[1-4]。因此，持续监测对于确保每当发生有害废物排放事件时及时响应至关重要。

化学分析通常用于检测水生环境中已知毒素的痕迹。但是，这种技术在很大程度上依赖于预先建立的标准，该标准规定了哪些化学药品和哪些浓度被认为是危险的。因此，它不能用于检测意外的危险化学品的存在。相反，生物监测系统可能反映了生物体在受到各种环境污染物挑战时发生的微妙的细胞和生理变化。

根据鱼类的生物多样性，种群和健康状况，它们被认为是理想的生物学监测生物。先前已经提出将鱼用作生物进行体内毒性试验[5]。正常条件下，例如生长，存活率和卵孵化率，可以用作监测参数。量化鱼类中酶防护的活性也是评估水质的常用方法。但是，由于多种生理，遗传和代谢因素可能同时影响这些多功能酶，因此对通过这些方法获得的数据的解释受到限制[6-12]。例如，混合功能加氧酶（MFO）或单加氧酶是许多代谢系统的重要组成部分，并且已在全球范围内的大量现场研究中得到验证。然而，必须分别测量包含细胞色素P450，细胞色素b5和NADPH细胞色素C还原酶的MFO组分的酶活性，以获得生物监测指数。而且，组织样本必须非常小心以防变性和/或蛋白水解。为了克服这些局限性，已经通过使用天然基因启动子开发了转基因鱼系，包括由多环芳香烃诱导的cyp1a1启动子[13,14]，或由热和其他胁迫诱导的热休克启动子[15]。.然而，由于这些启动子只对特定形式的压力作出反应，它们相对于传统化学分析的优势并不是特别显著。除了这个考虑 同样的，在给定的对动物无害的压力下，仍然可以诱导热休克启动子控制的报告基因的表达[15]。在这种情况下，报告活动与实际的生理压力几乎没有关系。因此，要使动物模型成为实用的生物监控器，要使动物模型成为一种实用的生物监测器，它必须（1）以准确性和敏感性对广泛的污染物作出反应，（2）动态跟踪生理应力。

为了实现这些目标，我们利用了斑马鱼转基因品系huORFZ，该品系具有GFP转基因，该GFP转基因受人DNA损伤诱导转录本3（ddit3，先前称为chop）cDNA上游上游阅读框（uORF）片段调控。 16]。最近的研究表明，基于uORF的翻译调控在CHOP蛋白的产生中起着重要的作用，即使不是主要的作用[17-19]，而chop基因是内质网（ER）应激最常用的生物标记之一[ 20,21]。我们发现，来自huORFZ系的胚胎在遇到压力时仅显示荧光信号，在正常情况下没有可检测到的泄漏。因此，huORFZ胚胎可以忠实地反映细胞应激。使用体内成像 我们进一步证明，该生产线可用于检测各种环境污染物，包括重金属和破坏内分泌的化学物质（EDC）。根据处理时间的不同，本研究中检测的几种常见污染物的检出限（LOD）等于或低于世界卫生组织（WHO）饮用水标准[22]。重要的是，发现不同的压力以剂量依赖性方式引起不同的GFP表达模式。此外，在将存活的经处理的胚胎恢复到正常状态后，存活率以及原位末端标记信号均恢复至预处理水平，未观察到明显的形态缺陷。这些结果表明本研究中使用的处理条件具有可逆性，只要胚胎能够存活下来即可。值得注意的是 GFP信号随恢复而下降，表明huORFZ胚胎的GFP信号可能反映了个体的整体生理状况。因此，由于可能不需要在各种生理条件下进行耗时且复杂的分析，因此使用huORFZ胚胎作为一种新型的荧光生物监测方法具有广阔的前景。

材料和方法

伦理声明

此研究严格遵循的动物实验方案已由台湾国立台湾大学IAC℃审查并批准，批准文号为NTU-102-EL-19。

畜牧业

所有野生型斑马鱼（Danio rerio）均为AB / TU菌株，斑马鱼Tg（-2.9krt18：RFP）[23]和huORFZ [16]的转基因品系杂交到AB / TU背景中。将所有鱼维持在28.5℃的温度下，光周期为14小时光照：10小时黑暗。所有鱼均按照《斑马鱼手册》 [24]中概述的准则进行饲养。在胚胎培养基（140 mM NaCl，5.4 mM KCl，0.25 mM Na2HPO4、0.44 mM KH2PO4、1.3 mM CaCl2、1.0 mM MgSO4和4.2 mM pH为7.2的NaHCO3）中培养胚胎，直至受精后24小时（hpf），通过在含有0.003％1苯基-2-硫脲（Sigma）的胚胎培养基中温育以防止色素形成。

化学制品

氯化锂（Sigma），五水合硫酸铜（Sigma），六水合硫酸镍（II），六水合硫酸锌（Merck），六水合氯化铝（Sigma），六水合氯化钴（Sigma），氯化铅（Sigma）和丙烯酰胺（Sigma）用于毒性测试。氯化镉（Merck），三氧化二砷（Merck），at去津（EQ Laboratories），毒死蜱（EQ Laboratories），呋喃丹（Chem Service），乐果（Chem Service），草甘膦（EQ Laboratories）和甲氧基氯（Fluka）由台湾农业委员会台湾农用化学品和有毒物质研究所。将重金属，丙烯酰胺，乐果和草甘膦溶解在无菌蒸馏水中制成储备液，而其他化学品则溶解或用二甲亚砜（DMSO）稀释至所需浓度，作为储备溶液。

压力处理

将所有胚胎置于10cm培养皿中培养并在28.5℃下孵育。受精72小时后开始所有毒性测试 ，在含有20个胚胎的3厘米培养皿中进行处理。胚胎首先用3mL蒸馏水洗涤一次。洗涤后，将液体除去，在盘中保留尽可能少的量。然后将3mL工作溶液添加到每个培养皿中。对照胚胎用等量的无菌蒸馏水或含DMSO的水处理。然后将胚胎放回设置为标准斑马鱼胚胎培养条件（28℃）的培养箱中。除非另有说明，否则每个实验均由针对每种处理条件的60个健康胚胎组成，分为三组（每组n = 20个胚胎）。每个实验设计独立重复三遍，然后汇总结果以计算百分比。通过对剂量响应数据的对数概率变换的线性回归计算，得到死亡率为10％，50％和90％的致死浓度[25]。表S1列出了本研究中使用的重金属和EDC的最终化学浓度。在存活率实验中，针对每种处理条件进行了20个胚胎的5次独立重复。在手稿中以均值6SD表示的数据是这五个独立实验的平均值，这些实验是在不同日期使用不同的胚芽进行的。对于恢复实验，在整个实验过程中，针对每种压力，每次重复时，一盘huORFZ胚胎都处于压力之下，

选择毒死蜱作为huORFZ幼虫中慢性毒性的代表。根据WHO指南中规定的饮用水水质值，以86 nM的毒死蜱对受精72 hpf的胚胎进行处理，并观察三天。解决方案每天刷新。对于半定量实验，针对每种处理条件进行了20个胚胎的两次独立重复。从每种处理条件和每次重复拍摄三到四个随机选择的活胚胎的图像。

蛋白质印迹

用1 x全细胞提取缓冲液（15 mM Tris-HCl pH 7.5、250 mM蔗糖，2 mM EDTA和0.2 mM PMSF）裂解斑马鱼胚胎，并通过10％SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移至PolyScreen PVDF杂交转移膜（PerkinElmer）。随后，用抗血清探测膜，包括1：1000稀释的抗GFP（Chemicon Millipore），1：500稀释的抗GADD153（小鼠CHOP同源物）（Abcam ab11419）和1：5000稀释的抗微管蛋白（Sigma）。用TBST溶液（0.2 M Tris，1.37 M NaCl和0.1％Tween-20，pH 7.6）洗涤膜，并用1：5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体（Santa Cruz Biotechnology）探测。用Western Lightning ECL Pro（PerkinElmer）检测结合的抗体，然后将其暴露于X射线胶片（Fujifilm）。

在受精后4天（dpf），将免疫组织化学 huORFZ幼虫在4℃下用4％多聚甲醛（PFA）固定过夜，并用30％蔗糖冷冻保护，然后在低温恒温器上水平切片20 m m。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤载玻片30分钟。随后将它们在封闭溶液（PBS，2％牛血清白蛋白，0.2％Triton X-100）中孵育30分钟。使用了以下一级抗体：抗GFP（Abcam; 1：200）和小鼠谷氨酰胺合成酶（GS）（克隆GS-6; 1：500）。用FITC缀合的二抗（Santa Cruz Biotechnology）检测GFP和Cy3缀合的二抗（Millipore）检测免疫组化信号。细胞核用49,6-二-2-基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma）复染色。

原位末端标记染色的huORFZ幼虫按照上述相同的方法固定并冷冻保护。在Cu 2 处理的胚胎上进行整个原位末端标记试验。将经Cd 2 处理的胚胎冠状切片，并按照制造商的规程（原位细胞死亡检测试剂盒TMR red，Roche）进行原位末端标记染色。将载玻片用PBST洗涤3次，每次5分钟，然后通过共聚焦显微镜检查图像。

显微成像

荧光图像通过荧光立体显微镜（MZ FLIII，Leica）与尼康D3数码相机或共聚焦光谱显微镜（LSM 780，Zeiss）结合使用。除非另有说明，否则本研究中使用的代表性图像代表实验组中超过75％的胚胎。

基于荧光图像的半定量分析

该分析是根据Noche（2011）[26]描述的程序进行修改的。简而言之，在Leica MZ FLIII荧光立体显微镜下拍摄绿色荧光图像，并将物镜设置为4倍。所有图像均为ISO 3200曝光4秒的侧视图。图像已保存为24位RGB<!--

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