英语原文共 11 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
电纺P34HB纤维:组织工程支架
摘 要
目的:第四代聚羟基丁酸酯是生物塑料聚3-羟基丁酸酯(P34HB);因此，有必要对其用途和应用进行新的研究。本研究的主要目的是确定电纺P34HB纤维是否能适应小鼠脂肪源性干细胞(mASCs)的生存能力、生长和分化。
材料与方法:在本研究中，我们观察了两种形式的P34HB，电纺P34HB纤维和P34HB薄膜。用扫描电子显微镜、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜对静电纺丝后的P34HB纤维和P34HB薄膜的形态进行了表征。分别用MTT法和CCK-8法进行细胞黏附、增殖和细胞毒性试验。成骨诱导培养后，通过real-time PCR检测成脂基因Runx2、OPN和OCN的表达。
结果:通过扫描电镜、光学显微镜和共聚焦激光扫描显微镜，我们观察到mASCs与P34HB材料生长良好。通过MTT和CCK-8分析，我们认为P34HB确实是一种适合进一步进行细胞粘附和增殖研究的材料。更重要的是，我们发现P34HB基质通过诱导成骨促进Runx2、OPN和OCN的表达。
结论:本研究证实电纺P34HB纤维对mASCs的存活、增殖和分化具有调节作用，并得出电纺法纤维支架材料在骨组织工程中的应用前景广阔的结论。
引言
组织工程可以被认为是供体组织的一种有前途的替代方法，供体组织的需求往往超过供应。虽然各种各样的组织工程支架已经被开发出来用于组织替代，但要制造出一种完美的、在临床上有用的组织工程支架的目标还远远没有实现。一个理想的组织工程支架应该是机械稳定的，并且能够在植入部位完成生物学功能[1]。
静电纺丝是一种有趣的生产无纺布的方法，其直径在亚微米到纳米之间。在这个过程中，从聚合物溶液中提取出连续的长丝，或者通过一个由高静电力引起的喷丝板“熔解”——然后沉积在一个接地的导电收集器上[2]。由于电纺纤维的高表面积与体积比以及在非织造布亚微米尺度上的高孔隙率，这些材料的潜在应用领域包括纳米纤维增强复合材料、用于酶和催化剂工作的纳米纤维载体以及纳米纤维膜。这些可用于许多生物医学应用[3-6]，包括药物传递、伤口愈合和组织工程支架。以往的静电纺丝材料主要集中在PLGA、PCL等。前人对第四代聚羟基烷酸酯(PHA)即生物塑料聚3-羟基丁酸酯(P34HB)的研究较少。
多羟基烷酸盐与各种碳和能量储备物质具有相似的结构，在某些种类的细菌胞内发现[7]。由于其适当的生物降解性和生物相容性，聚苯乙烯作为一种环境友好型塑料受到广泛关注，广泛应用于农业、海洋和医疗领域[8]。该领域最早的研究始于上个世纪。1926年，在法国巴黎的巴斯德研究所，Lemoigne首次从巨大芽孢杆菌中发现并分离出细胞，从中可以提取出第一代PHA生物塑料3-羟基丁酸均聚物(PHB)。由于PHB脆性大，断裂伸长率低，热稳定性差，易加工，因此受到的关注较少;然而，在20世纪70年代后期，由于石油危机和环境保护的要求，PHB开始被进一步研究。随后，合成了PHA第二代、生物塑料PHBV和第三代生物塑料PHBHHX，并显著改善了材料的性能。遗憾的是，仍然存在缺陷。1992年，美国Metabolix公司成功开发了第四代PHA生物塑料-poly-3-羟基丁酸酯- 4-羟基丁酸酯(P3HB4HB或P34HB)。生产成本很快下降，而P34HB材料的性能(如更好的韧性)也使其成为一个重大突破。Tepha公司进行的研究证实，通过改变4HB的分数[9]可以控制P34HB的生物降解速率，该共聚物在生物医学和环境领域中表现出理想的性能[8,10];这使得学术界和工业界对它的研究兴趣日益浓厚[9,11 – 17]。它克服了均聚物聚3-羟基丁酸酯(PHB)的脆性和加工窗口狭窄[18]，并按照3-8 mol% 4-羟基丁酸酯[19]从45扩展到100%断裂。
要成为一种成功的种植体生物材料，必须满足种植体降解可控、天然组织与支架完全融合等进一步的要求。基于PHAs的P3HB4HB降解产物为低聚物，包括oligo(3-羟基丁酸酯)(OHB)和oligo(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基己酸酯)(OHBHHx)。先前对小鼠beta细胞的研究直接证实了这些降解产物对细胞生长有积极作用[20]。为了进一步促进该材料的应用，本研究确定了P34HB作为一种适合骨组织工程的静电纺丝材料的性能。
间充质干细胞是由成体器官和组织(包括骨髓、韧带、肌肉、脂肪组织和牙髓)分化而来的一组多能干细胞[21-23]。它们经历了几代人的自我更新，同时保留了分化成多种组织如骨骼、软骨、肌肉和脂肪的能力[24]。甚至人脂肪源性干细胞(ASCs)也很容易获得，相对容易地从选择性手术标本中分离出来，比如去除多余的脂肪组织。一些研究集中在人类胚胎干细胞来源的上皮细胞和造釉细胞系细胞之间的相似性[25]，ASCs和造釉细胞系细胞之间也可能存在关系。
尽管有这些有价值的研究，但很少有人关注P34HB和电纺P34HB纤维是否有希望成为组织工程的支架材料。在这里，我们的目标是确定电纺P34HB纤维是否能适应小鼠脂肪源性干细胞(mASCs)的生存能力、生长和分化。
材料和方法
聚合物支架的制作
在一夜的涡流处理下，将1.0 g PHA生物塑料聚3-羟基丁酸酯- 4-羟基丁酸酯(清华大学捐赠)混悬于含(4:1,v/v)氯仿和二甲基甲酰胺(DMF)的20 ml有机溶剂混合物中，得到PHA溶液;西格玛，圣路易斯，密苏里州，美国)。在静电纺丝过程中，聚合物溶液被放置在装有21G针头的10ml玻璃注射器中，以提供1ml /h的流速。注射器固定在水平方向向下倾斜45°的位置。喷丝头与接地目标电极之间施加12 - 20kv电压;集铜板(阴极)与针尖(阳极)之间的距离为12-15厘米。聚合物溶液从注射器中抽出，在重力和静电荷的作用下，在针头的顶端形成一个垂坠。一个带正电荷的喷射物从水滴中喷射到带负电荷的目标上。因此，在收集板上形成了纤维结构，然后小心地将收集板取下，供以后使用。另一方面，P34HB膜是通过将聚合物溶液置于玻璃皿中，并允许挥发性液体蒸发而得到的。电纺P34HB纤维和P34HB薄膜厚度均控制在1mm。
MASC的分离和培养
根据《国际动物研究指导原则》(1985)，本研究采用四川大学动物中心的昆明小鼠和四川大学的绿色荧光小鼠。将小鼠腹股沟脂肪垫剥离，用无菌PBS冲洗以清除组织碎片。然后用0.075% I型胶原酶(Sigma-Aldrich)在PBS中消化脂肪垫，37℃条件下搅拌60分钟。胶原酶中和后，从标本中释放的细胞经过滤后，以1200 g离心收集10 min。所得到的球被重悬，在培养基中洗涤三次，细胞接种在塑料烧瓶中作为对照培养基(a-MEM, 10%胎牛血清)。培养物保存在37℃5% CO2的湿化气氛中，得到的masc传代三次，然后进行鉴别或测量。
扫描电子显微镜(SEM)
电纺P34HB纤维和P34HB薄膜(被切成圆形，以适应96孔板的井径和1毫米的厚度)被放入96孔板中。所有物料在紫外线照射下消毒半小时。以适当的初始密度将第三代绿色荧光质粒接种到上述制备的96孔玻璃底板中。在基本培养基中培养1、3、5和7天后，分别在细胞种前和种后20 kV加速电压下，用SEM (HITACHI S-4800，日本东京)和EDS (alpha ray spectrometer，牛津仪器，英国牛津)对电纺P34HB纤维和P34HB薄膜的形态进行了表征。
用绿色荧光质谱观察细胞在基质上的生长
在96孔板的孔中制备了P34HB电纺纤维、P34HB薄膜和mASCs。将绿色荧光质粒接种于无支架材料的6孔板，作为对照组。每组设置两排平行的井。在基础培养基中培养1、5、7天后，用Olympus IX 710显微镜(Olympus，日本东京)观察细胞并拍照。
共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)
在96孔板的孔中制备了P34HB电纺纤维、P34HB薄膜和mASCs。每组设置两口平行井。种植绿色荧光mASCs 7天后，用激光共聚焦显微镜(LSCM、LEICA TCS SP2;莱卡微系统，海德堡，德国)，以此建立三维图像。
细胞粘附、增殖和细胞毒性试验
在96孔板的孔中制备了P34HB电纺纤维、P34HB薄膜和mASCs。对照组mcs接种于96孔板，不加支架材料。每组设置三排平行的井。在基本培养基中培养2、4和8小时后，用3-(4,5-二甲基噻唑-2yl)-2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT)法测定活细胞数量，以确定细胞对电纺P34HB纤维和P34HB膜的粘附程度。MTT法是通过代谢活性细胞线粒体分泌的脱氢酶将黄色四唑盐还原为紫色的福尔马赞晶体。所形成的紫色福尔马赞晶体的数量与活细胞的数量成正比。
首先，将每种培养基抽吸，用每孔MTT溶液200 ll替换，每96孔培养板0.1 mg/ml。其次，37℃孵育4小时。然后抽吸溶液，加入每孔150 ll的二甲基亚砜(DMSO)来溶解福尔马散晶体。最后，在旋转搅拌10分钟后，使用热谱仪Genesis 10UV/可见光分光光度计(Thermo Electron Corp, Madison, WI, USA)测量DMSO溶液在570 nm处的吸光度。
基本培养基中培养1、3、5和7天后，使用细胞计数kit-8 (CCK-8)(日本熊本市渡津岛)对活细胞进行定量，以确定电纺P34HB纤维和P34HB膜上细胞增殖和细胞毒性的程度。每孔加入10 ll细胞计数测定试剂盒-8溶液，37℃孵育1-4h，形成水不溶福尔马散。然后使用微平板阅读器(Vari Oskan Flash 3001;热)。细胞中脱氢酶活性产生的福尔马赞染料的量与活细胞的数量成正比。
提取总RNA, RT-PCR
将mASCs接种于电纺P34HB纤维和P34HB膜上，半小时后提取RNA;随后分别进行1、3、5、7天的成骨诱导培养。通过real-time PCR检测RUNX2、OPN和OCN的转录水平。最初，根据制造商的协议，使用total Tissue Cell RNA Extraction Kit (Watson, Yunnan, China)提取细胞的总RNA。总RNA (11 ll)在20 ll逆转录系统(Fermentas，维尔纽斯，立陶宛)中逆转录为cDNA。根据《分子克隆:实验室手册》(2001年第3版)中概述的方法，使用琼脂糖电泳检测每个样本的总RNA和cDNA。利用RT-PCR试剂盒(天干，北京，中国)扩增cDNA样本，引物见表1。利用Real - Time PCR和SYBR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)试剂盒(Takara, Tokyo, Japan)定量表达特异性基因;反应是在ABI 7300系统上进行的(ABI, Foster City, CA, USA)。每个反应生成一条熔化曲线，测试引物二聚体的形成和假引物，然后用双标准曲线法对mRNA水平进行相对定量。为了比较不同数量样品中靶基因的转录水平，我们使用GAPDH的表达对real-time PCR结果进行归一化。
数据分析与统计
我们进行了三组或更多的独立实验，每个实验至少运行三次。采用SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)进行统计分析。所有数据均以均数/标准差表示。数据分析采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Student - Newman-Keuls检验;P lt; 0.05为差异有统计学意义。
表1 目的基因引物序列与GAPDH进行实时PCR检测
|
目的基因（小鼠） |
引物序列(5rsquo;–3rsquo;) |
|
Runx2 |
F: CCGAACTGGTCCGCACCGAC R: CTTGAAGGCCACGGGCAGGG |
|
OPN |
F: GTGGTGATCTAGTGGTGCCAAGAGT R: AGGCACCGGCCATGTGGCTAT |
|
OCN |
F: GTCCTATGGCGGGGAGGACTGG R: TGGCAGCTGCAAGCTCTCTGTA |
|
GAPDH |
F: TATGACTCTACCCACGGCAAGT R: ATACTCAGCACCAGCATCACC |
结果
电纺P34HB纤维和P34HB薄膜在mASC播种前后的形态
扫描电镜的图像实际上电纺P34HB纤维细胞播种前和P34HB电影透露,实际上电纺的结构P34HB随机取向的纤维提供粗纤维,多孔表面(图1),而P34HB电影没有纤维的结构和表面相对光滑,无特色的(图1 b)。在电纺P34HB纤维和P34HB膜上分别接种1、3、5、7 d后，经扫描电镜观察，形态和质量有明显差异(图2)。在播种7天后，mASCs附着在电纺P34HB纤维上，并渗透到纤维之间的孔隙中;与接种1、3和5天的masc相比，细胞数量显著增加(图2d)(分别为图2a-c);在播种后1天，细胞形状较圆(图2a)，而播种后7天细胞形状较长(图2d)。这表明有籽的masc越来越多地附着在电纺P34HB纤维上
剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[245709]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
