解脂耶氏酵母油脂积累研究进展外文翻译资料

 2022-08-07 15:27:01

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Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica

解脂耶氏酵母油脂积累研究进展

Zbigniew Lazar, Nian Liu, Gregory Stephanopoulos

摘译自：https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.06.007

对气候变化的担忧推动了生产可再生油脂类生物燃料的研究。利用油性酵母进行脂质合成，由于其独特的新陈代谢使其能够达到高的脂质效价、产量和生产力，从而创造了具有成本效益的工业化潜力。解脂耶氏酵母是产油酵母的模型，拥有最充分的脂质代谢相关研究，最多的遗传工具，以及完全测序的基因组。在这篇综述中，我们重点介绍了多组学研究，这些研究阐明了解脂耶氏酵母实现脂质过度积累的机制，然后介绍了几种主要的代谢工程研究，这些研究提高了解脂耶氏酵母的生产指标，最后介绍了新颖的工程策略相关最新成果。

解脂耶氏酵母油脂合成与代谢

当代社会严重依赖化石燃料(石油、煤炭和天然气)作为能源[1]。然而，对气候变化的担忧推动了人们对可再生液体燃料的研究[2]。这些新技术需要以具有成本效益和可持续的方式提供燃料，同时为减少温室气体做出贡献[3]。由微生物生产的生物燃料，主要是生物乙醇和生物柴油。其中，脂基生物柴油由于其较高的能量密度而备受关注，与其他形式的可再生能源相比，这使其成为柴油和喷气燃料的优越替代品。生物柴油的成本效益取决于几个重要的标准，包括油脂含量、油脂效价、油脂产量和油脂生产力。因此，擅长积累细胞内脂质的油性微生物常被选为工业主力菌。Yarrowia.lipolytica（解脂耶氏酵母）,是一种属于Yarrowia属的油性酵母[4，5]，被广泛认为是实现这一目的的模式生物[6]。它的脂质代谢相关途径已经得到了广泛的研究，它拥有过多的基因工程工具，它的基因组已经完全测序[7-14]。最近，无处不在的基因组编辑技术CRISPR-Cas9在解脂耶氏酵母中也得到了应用，它允许高频同源重组以及有针对性的基因插入和删除[15，16]。这些特性增强了解脂耶氏酵母实现工业化生产经济生物柴油的潜力。

为了有效地改造解脂耶氏酵母以促进脂质的积累，必须首先对其新陈代谢有一个透彻的了解。从头合成脂质需要细胞协调各种生化途径，这些生化途径可以从葡萄糖或其他小分子碳底物(如糖、有机酸和醇)中产生三酰甘油（TAG）。当培养基中的氮变得稀缺时，此过程被激活，从而导致一系列级联调节反应。最初，氮限制会由于AMP脱氨酶1（AMPD1）循环胺基而导致细胞内AMP含量快速下降。低AMP浓度抑制异柠檬酸脱氢酶（IDH），导致三羧酸（TCA）循环的下调，使得柠檬酸在线粒体中积累以及过量的柠檬酸从线粒体输向细胞质中。在下一步中，柠檬酸被ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）裂解为胞质乙酰辅酶A和草酰乙酸。 总体而言，该途径不同于传统酵母所用的丙酮酸-乙醛-乙酸途径，是油性微生物的特征，它可以形成脂质合成的起始材料细胞质乙酰辅酶A。

一旦细胞质中的乙酰辅酶A形成，它就可以作为合成脂肪酸(FA)的双碳构件。脂肪酸的延伸始于乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的作用，催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。然后，FA合成酶复合体(FAS1和FAS2)作用于丙二酰辅酶A，生成碳十六酰基-ACP，然后这些碳十六酰基-ACP被运输到内质网(ER)，进一步延长和去饱和度[17-19]。内质网中的去饱和酶OLE1催化产生棕榈油酸(C16：1)和油酸(C18：1)，FA去饱和酶2(FAD2)催化产生亚油酸(18：2)。脂肪酸合成的总化学计量比为

AcCoA ATP （n-2 m）NADPH→C(n：m)FA

其中n和m分别是链长和不饱和度。这一过程在很大程度上依赖于ATP和NADPH的可利用性。

三酰甘油由三个脂肪酸通过肯尼迪途径与一个3-磷酸甘油(G-3-P)缩合而成[9]。最初，G-3-P被G-3-P酰基转移酶(SCT1)酰化，形成溶血磷脂酸(LPA)。LPA随后被LPA酰基转移酶(SLC1)酰化，产生磷脂酸(PA)。然后，PA被PA磷酸酶(PAP)去磷酸化，释放出二酰基甘油(DAG)。最后，以酰基辅酶A为最终酰基供体的DAG酰基转移酶(DGA1或DGA2)或以甘油磷脂为酰基供体的磷脂DAG酰基转移酶(LRO1)合成TAG。这些反应发生在内质网和脂质体(LB)表面上，相关酶位于LB表面[20]。图1总结了脂质合成的途径。

图1. 解脂耶氏酵母脂肪合成代谢网络。不同颜色的箭头用来表示不同的代谢途径：绿色，底物掺入反应；蓝色，糖酵解/糖异生；橙色，三羧酸(TCA)循环及相关的停滞反应；灰色，磷酸戊糖途径；深蓝色，乙醛酸分流；黄色，三酰甘油(TAG)合成反应；红色，beta;-氧化途径。图中还描述了细胞内的各种细胞器(线粒体、过氧化物酶体、内质网和脂质体)与代谢途径的关系。

除了合成途径外，油脂降解途径也与解脂耶氏酵母油脂的过量积累有关，因为它们经常成为被敲除的目标途径。游离脂肪酸(FFA)可以通过细胞内脂肪酶TGL4[11，21]的作用水解。水解的游离脂肪酸必须通过酰基-辅酶A合成酶(FAA1)活化为酰基-COA，才能进行进一步的生物加工[22]。这些长链酰基COA被beta;-氧化途径降解(图2)发生在过氧化物酶体中。在beta;-氧化反应中有四个反应以循环方式发生，其综合效应是释放乙酰辅酶A分子，从而将酰链缩短两个碳单元。在解脂耶氏酵母中，鉴定出6个催化第一反应的酰基辅酶A氧化酶(POX1-6)，每个酶具有不同的链长偏好[11，23，24]。第二个和第三个反应由多功能酶(MFE1)催化，最后一个反应由3-酮酰辅酶A硫解酶(POT1)[11，25，26]催化。这些酶通常是敲除的目标。

图2. beta;氧化途径，以循环方式将脂肪酸降解为乙酰辅酶A。

用多组学方法理解脂质合成的过程

为了进一步扩大对解脂耶氏酵母脂质代谢的认识，并确定代谢网络中的瓶颈位置，定量生物学测量在该生物体的研究中变得越来越流行。这些研究通常指导后续的工程策略以达到最佳效果。Wasylenko和他的同事在葡萄糖培养的解脂耶氏酵母上进行了13C代谢通量分析(MFA)，并比较了野生型菌株和工程菌株之间的通量分布[12]。作者得出结论，NADPH的可用性限制了脂质的合成。通过比较两个菌株之间的通量变化，他们还能够推断，合成脂质所需的NADPH几乎完全是从氧化戊糖磷酸途径(PPP)合成的。这证实了之前的基因组研究表明解脂耶氏酵母没有苹果酸酶的细胞质拷贝[29]，这使得这种酵母与其他油性微生物相比是独一无二的。一项类似的研究分析了乙酸培养的解脂耶氏酵母的通量分布[13]。这证明了糖异生在支持生物量前体合成和脂源性NADPH合成方面的重要性。另外还鉴定了一个通过糖异生来控制通量的调控节点。

许多其他的分析也阐明了解脂耶氏酵母脂质代谢的重要机制。应用的方法包括基因组规模的模型重建和分析，以及转录组、代谢组、脂质组和蛋白质组测量[29-34]。Morin和他的同事进行的转录组分析表明，许多基因的表达水平明显不同，这取决于解脂耶氏酵母是在降解还是在合成脂质[29]。此外，他们得出结论，脂质积累可能是被动碳通量重新布线到胞质乙酰辅酶A的结果，而不是在转录水平上受到控制。Liu和他的同事[31]观察到了类似的现象，过量的碳流向脂质生物合成可能是糖酵解和TCA循环活性失衡的结果。然而，与蛋白质合成相关的基因，包括编码核糖体亚基、翻译起始和延伸因子的基因被主动下调[31]。对解脂耶氏酵母菌株的多组学分析证实了这一观察结果，这些菌株在碳和氮限制条件下表现出过度产脂的表型[30]。尤其是，脂质积累不涉及脂质代谢的转录调控，但是显然与氨基酸生物合成的调控相关。与氨基酸新陈代谢相关的基因下调，而那些涉及蛋白质周转和自噬(提供替代氮)的基因则过度表达。影响脂质合成的一个特别重要的因素似乎是亮氨酸代谢[34]。有趣的是，作者提供了一些证据，指出了几个仅与氮限制和DGA1过度表达相关的特定调控，展示了细胞的代谢工程如何改变基因调控。最后，使用蛋白质组学方法，Pomraning和他的同事[33]证明ACL、ACC和卵磷脂胆固醇酰基转移酶在氮限制期间被磷酸化[33]。这一观察结果提示翻译后修饰在调节脂质积累中的重要性。

通过代谢工程提高解脂耶氏酵母油脂积累

解脂耶氏酵母的野生型菌株并不是最有效的油脂生产菌。例如，环状红孢子菌可以自然地积累细胞中70%的油脂含量，而解脂耶氏酵母通常在天然情况下可以积累20-40%的油脂含量[35-37]。但是，利用解脂耶氏酵母生产油脂的优势在于能够改变其新陈代谢[14，16，38]。在过去的几年里，专注于提高解脂耶氏酵母油脂产量的研究已经有了相当大的扩展，不同的研究小组采用了不同的工程策略(图3)。

图3.提高解脂耶氏酵母油脂生物合成的不同途径

脂质的生物合成可以通过几种不同的方式来改善(图1)。每种方法都有不同的方法，但它们最终都以最大化细胞内脂质积累为最终目标。

Ⅰ传统的研究方法包括野生型菌株和培养基成分的优化，以及温度、pH和曝气等工艺参数的优化。

Ⅱ在基因工具开发之后不久，代谢工程就作为一种手段出现了，它可以根据不同的需要改变有机体的功能，包括改善脂质合成。这考虑了脂质生物合成和相关途径中的已知基因和酶，通过过度表达或缺失改变它们的表达水平，并调节酶的性质。

Ⅲ 现在，测序和注释的基因组(基因组学)与细胞内外代谢物检测(代谢组学)、成套蛋白质分析(蛋白质组学)和转录组(转录组学)定量的方法相结合，使科学家能够详细研究解脂耶尔森氏菌的脂质代谢及其调控。相互补充的不同技术的结合产生了一门名为系统生物学的新学科。

Ⅳ在涉及用某些软件重建基因组规模的模型的电子代谢建模中，无需进行大规模的湿实验室实验，就可以预测瓶颈步骤。这些方法，如果实施得当，往往可以非常准确地预测某些代谢修饰如何改变有机体的表型。因此，研究人员经常使用建模来指导工程。

Ⅴ通过在代谢工程学上应用计算机建模和系统生物学，可以构建具有高脂质合成潜能的新菌株。然后需要对新菌株进行另一轮工艺优化或发酵。可能需要多次迭代才能获得系统的全部功能。

Ⅵ目前，合成生物学的发展极大地推动了解脂耶氏酵母等生物系统的工程化。借鉴其他工程领域的原理，研究人员现在可以建立人工的和可调的生物电路，这极大地促进了碳通量进入所需的脂质和基于脂质的分子生物合成途径。

脂质降解作为脂质合成的拮抗途径，阻碍了脂质的积累，因此相关基因已成为敲除的主要目标[11，24]。例如，在工程菌株中敲除了MFE1基因产生了脂质过度积累的表型[26，39，40]。同样，负责过氧化物酶体生物合成的编码蛋白PEX3、PEX10和PEX11的基因也被敲除，以完全取消beta;-氧化活性[41，42]。细胞代谢调控因子的敲除也有利于脂质的积累[43，44]。例如，SNF1缺失的解脂耶氏酵母菌株积累的FAs达到比野生型高2.6倍的数量。在一株能产生omega-3二十碳五烯酸的工程菌中，SNF1的缺失也观察到了类似的现象，这些菌株的EPA效价[细胞干重(CDW)的7.6%]，相比对照菌增加了52%[43]。尽管取得了一些成功，但SNF1如何调节脂质合成途径的机制还不清楚。在MIG1基因缺失的菌株中也发现了类似的观察结果[44]。当脂质含量增加到48.7%时，突变细胞比其亲本细胞显示出更多的脂质体（LBs），猜想可能是由于MIG1的缺失下调了MFE1，上调了其他与脂质生物合成相关的基因。最后，基于糖原和TAG合成相互竞争的假设，因为它们是两个主要的碳储存单位，Bhutada和他的同事在糖原合成酶(GSY1)上进行了无效突变，与野生型菌株相比，TAG含量增加了60%[45]。

尽管上面列出的工作证明了针对脂质过度积累的目标基因敲除是成功的，但在解脂耶氏酵母中执行敲除是具有挑战性的，因为这种酵母优先使用非同源末端连接(NHEJ)机制进行DNA修复，而不是同源重组(HR)[46]。相比之下，基因的过表达很容易进行。一种简单而有效的提高解脂耶氏酵母脂质产量的方法涉及到基于ACC1和DGA1过表达的“推拉”策略[47]。在生物反应器中，这两个基因的联合过表达显著提高了产脂率，脂质含量达到61.7%，葡萄糖的总产量和生产力分别为0.195 g/g和0.143 g/l/h。

在工程化菌株的早期阶段，结合基因过表达和敲除来大幅改变解脂耶氏酵母脂质相关的代谢是占优势的[48，49]。Lazar和他的同事将POX1-6和TGL4的敲除与GDP1和DGA2的过表达结合在一起[39]，由此产生的菌株具有减少FA的降解和增加细胞内G-3-P浓度以促进TAG合成的作用。通过过表达己糖激酶以改善果糖代谢和引入转化酶以更好地利用蔗糖，进一步优化了这些策略[4

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