重组贻贝粘附蛋白fp-3体粘附强度的比较研究外文翻译资料

 2022-08-08 10:06:54

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重组贻贝粘附蛋白fp-3体粘附强度的比较研究

一、概要

贻贝粘附蛋白(MAP)3型(fp-3)是贻贝粘附的关键成分之一。然而，由于其数量有限，其本体粘合强度还未得到表征。在目前的研究中，实现了重组fp-3的可行生产(～47 mgl-1 ),并首次测量了其本体粘合强度；未改性形式的～0.57 MPa和3，4-二羟基-L-苯丙氨酸(多巴)改性形式的～0.94和～2.28 MPa，无氧化和氧化处理的情况下可达到9.6%的产率。此外，还对几种多巴修饰的重组MAPs的整体粘合强度值进行了比较。氧化处理后多巴改性的fp-3的最大粘合强度强于5型(fp-5)，改性产率可以达到6.2%，与杂交型fp-131和fp-151相当(～5%)。重组fp-3的强体粘附特性，可使其成为一种很有发展前景的生物粘合剂。

二、简介

海洋生物生活在恶劣的环境中；尤其有些暴露在波浪和潮汐中，但却仍然可以附着在岩石上。在海洋附着研究中，最常见的便是贻贝的附着。

海洋贻贝使用贻贝粘附蛋白(MAPs)附着在潮汐区的底层，以粘附和保护自己免受潮汐作用。MAPs含有翻译后修饰的氨基酸3，4-二羟基-L-苯丙氨酸(DOPA)，它是通过酪氨酸残基的羟基化进行转化。

多巴被认为是形成强粘附的关键因素。它可以通过螯合或形成共价键与金属离子和氧化物形成氢键和络合物，这也就解释了为什么它能对各种表面形成快速、强粘附。多巴醌是多巴的一种氧化形式，能与其他多巴醌分子和半胱氨酸残基的巯基形成交联，从而提供内聚的相互作用。

迄今为止，已经发现了六种类型的MAPs，包括足蛋白1型(fp-1)至6型(fp-6)；每种蛋白质分布在特定的位置，并发挥不同的作用(图1A)。足蛋白3型(fp-3)是斑块蛋白中多态性最高的一种蛋白，有多达35个变异体(表1)，其中20种来自紫贻贝，2种来自紫贻贝，12种来自加州紫贻贝。由于其翻译后修饰，fp-3含有广泛羟基化的氨基酸，如DOPA和4-羟基精氨酸。它的多巴含量特别高，可达到为10-20mol%。此外，由于含有大量的碱性氨基酸，fp-3有较高的pI值(高于～10.5 ),但在所有足蛋白中fp-3分子量最低，约为～6 kDa。fp-3蛋白定位于基质表面与贻贝足丝菌斑之间的界面。较高的DOPA含量和在斑块中的位置表明fp-3可能在粘连中起重要作用。在以往的研究中表明，fp-3参与基质和斑块之间的表面粘附，起介导贻贝粘附的引物样作用。

作为一种表面粘附蛋白，fp-3凭借其优异的性能，如强防水的粘附性、生物降解性和生物相容性，可作为商业生物粘合剂应用于多个方面。然而，fp-3的天然可提取量远低于实际所需应用。尽管在大肠杆菌中尝试了功能性重组fp-3的分子生物技术表达，但只能产生少量的mgl-1，由于天然和重组fp-3的可用性有限，其粘附性能仅能通过微尺度分析工具进行研究，包括石英晶体微量天平、原子力显微镜和表面力仪(SFA)。据作者所知，fp-3的膨体胶接强度尚未确定。

在本研究工作中，通过消除信号序列和密码子优化，对在大肠杆菌中实现有效地大量生产的来自加洛韦分枝杆菌的重组fp-3变体A的体粘附强度进行研究。此外，还对几种重组MAPs的本体粘附强度值，5型足蛋白(fp-5)(表1)和两种杂交类型fp-151和fp-131进行了比较(表1)。

三、材料和方法

3.1 载体的构建

利用化学合成的方法合成mgfp-3A基因，基于优选大肠杆菌密码子，使该基因使用优化的密码子消除信号序列，基于大肠杆菌密码子使用偏好，利用化学合成的方法合成消除信号序列的密码子优化的mgfp-3A基因，以包括限制性酶位点NdeI和XhoI。用NdeI和XhoI酶切合成的基因，并插入到pET-23b质粒中，以产生更优质利用更强的T7启动子。最后，即可获得重组载体pET-fp3 h(图1B)，并可以通过直接测序证实基因的导入。

图1

3.2 重组fp-3的表达和纯化

E.coli BL21 (DE3)被用作表达重组fp-3的宿主菌株。将重组载体pET-fp3h转化到大肠杆菌中。50ml LB培养基和50mu;gml氨苄青霉素中在37℃下过夜培养携带pET-fp3h的重组细胞。在10L生物反应器中将培养物转移到5L含有50mu;gml-1氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃和250rpm下培养，直到达到600nm(OD600)的光密度值直到OD600达到~5。添加1mM IPTG，并将培养物在37℃和250rpm下进一步培养5小时。在4℃下以10，000g离心20min来收获细胞。将细胞沉淀储存在-80℃。

重组fp-3(图1C)在其C端含六组氨酸(His6)标签，以便能够使用固定的金属亲和层析固定化金属亲和层析进行纯化。将收获的细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl和8M 尿素；pH 8.0)。将重悬的细胞置于冰上，用超声波破碎器破碎15分钟，采用破3秒停7秒的模式，并使每个脉冲冷却。裂解物在4℃下以10，000g离心15分钟。收集上清液，并在室温下与Ni-NTA树脂一起孵育30分钟，使His6标记的fp-3与Ni-NTA树脂结合。然后，将混合物装载到柱上。用10-20倍树脂体积的洗涤缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM Tris-Cl和8M 尿素；pH 5.9) 洗涤树脂。重组fp-3在0.5M盐酸中洗脱。用蒸馏水(DW)将洗脱的fp-3蛋白溶液稀释两次，并用截留分子量为3500Da的透析膜在DW中透析三次。将纯化的重组fp-3冷冻干燥并储存在-80℃。

图1

3.3 MALDI-TOF质谱分析

将冻干的重组fp-3溶解在DW中，并进一步稀释在alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液(5mg ml-1溶于50%乙腈和0.3%三氟乙酸中)中。将1mu;l蛋白质/基质溶液样品点样到基质辅助激光解吸/电离(MALDI)板上并干燥。样品用MALDI-飞行时间(TOF)/ TOFTM质谱(MS)系统。

3.4 体外多巴修饰和NBT染色

体外酪氨酸酶处理，将酪氨酸残基修饰成多巴分子。冻干的重组MAP粉末在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中溶解至最终浓度为～1mg ml-1，需要用到25mM抗坏血酸作为抗氧化剂和50mu;g ml-1来自双孢蘑菇的蘑菇酪氨酸酶。将混合物轻轻摇动孵育6小时，然后在5%(v/v)乙酸中透析一次，在DW中透析两次。多巴修饰产率被确定为每总酪氨酸含量的多巴含量。用IRPH测定法分析酪氨酸酶处理过的MAP(mussel adhesive protein）的多巴含量。总酪氨酸含量基于使用布拉德福蛋白质测定法测定的蛋白质浓度进行分析。最后，将改性的MAP冷冻干燥并储存在-80℃。

携带醌类和相关醌类物质如多巴和多巴醌的醌蛋白可以在碱性pH值下，在硝基蓝四唑(NBT)和甘氨酸盐存在下，通过氧化还原循环染色进行特异性检测。对于NBT染色试验，冻干的未修饰和DOPA修饰的MAPs在5%(v/v)乙酸中溶解至最终浓度为1mg ml-1。将3mu;lMAP溶液滴在硝酸纤维素转移膜。将该膜浸入含0.5mg ml-1 NBT的2M甘氨酸钠缓冲液(pH 10)中，并在室温下孵育，直到出现蓝紫色。用0.2M硼酸钠溶液(pH 8.5)和去离子水洗涤染色的膜。

3.5 散装粘合剂强度的测量

重组MAP的整体粘合强度以剪切强度的形式使用铝粘附体(10mm宽times;100mm长)进行测量，在端部附近凿一个孔。铝粘附体的表面在室温下用5%(w/v)的NaOH溶液蚀刻5分钟，并用去离子水洗涤。为了去除蚀刻形成的污迹层，在室温下将蚀刻的表面浸入30% (v/v)HNO3溶液中1分钟，并用DW洗涤。最后，将粘附体在室温下风干。为了分析重组磷酸腺苷的整体粘合强度，将10mu;l 50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)滴到粘附体表面的末端，并与冻干的磷酸腺苷混合。将混合物涂在一张10mmtimes;10mm纸上，并附有另一个铝被粘物。用镊子夹起10mmtimes;10mm重叠的被粘物区域，以保持两个被粘物接触并平行。测量前，样品在37℃下固化4小时。使用相同的方法测量多巴改性的磷酸二铵的本体粘合强度。为了研究氧化剂效应，使用10mu;l含有50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的氧化剂。选择高碘酸盐（IO4-）作为氧化剂，用高碘酸钠（NaIO4）生成高碘酸盐。用万能材料试验机，附有2000N称重传感器；粘附力(Pa)通过剪切力(N)除以重叠粘附体面积(平方米)获得。这些粘附研究是ASTM D1002标准方法的改编。每次粘合强度的测量至少重复四次，并对给定的样品取平均。牛血清白蛋白用作阴性对照。

四、结果与讨论

4.1 重组fp-3的表达和纯化

尽管以前在大肠杆菌中成功表达了重组fp-3，但由于表达水平相对较低(总细胞蛋白的～3%)和最终纯化产量较低(～18%)，纯化和冻干蛋白的量仅为培养物的～0.8mgl-1。在本工作中，由于信号序列消除的fp-3基因被共优化，并且使用T7启动子代替trc启动子，重组fp-3的表达水平大大提高，达到总细胞蛋白的～56%。约一半的fp-3以可溶性形式表达，另一半则以不溶性蛋白形式表达(图2A)。

用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白fp-3。纯化步骤在变性条件下进行，使用8M尿素，通过溶解不溶性组分来提高纯化产率。最后，从实验室规模的培养物中获得了～47mgl-1的纯化重组fp-3(图2A)，这比先前报告的产量高约50倍。纯化重组fp-3的最终产量与先前研究中获得的纯化重组fp-5的量相似。用MALDI-TOF MS分析纯化的重组fp-3，可以确认正确分子量在～6.7kDa(图2B)。

图2

4.2 重组fp-3体粘附强度的测定

首先，测量未改性的重组fp-3的体粘接强度。由于其具有良好的表面再现性和易于处理的特点，铝附着体被用来测量重组fp-3的剪切强度，和已发表的研究进行比较。37℃空气固化4h后测定试样的大块粘结强度(图3A)。未修饰的无多巴残基重组fp-3的体剪切强度为0.57plusmn;0.21MPa(图3B)。先前的研究也表明，其他未修饰的重组图具有较高的体粘接强度。组氨酸可以结合金属离子。重组fp-3在c端有一个His6标签，由于使用铝作为粘附体，预计His6标签与金属表面的相互作用可能有助于未改性fp-3的粘附性能。然而，硬金属离子包括铝，优先与水、富氧基团，如天冬氨酸和谷氨酸相互作用，而不是含氮的氨基酸，如组氨酸。因此，His6标签和铝表面之间的相互作用对未改性fp-3的粘附性能的贡献可能是最小的。

研究了多巴改性重组蛋白fp-3 (mfp-3)在含氧化剂和不含氧化剂条件下的体粘接强度。既往研究表明粘附强度与DOPA含量相关。利用酪氨酸酶对重组fp-3进行修饰，酪氨酸酶可催化酪氨酸残基羟基化生成多巴和多巴-醌。重组fp-3的多巴修饰率为9.6%。在相同的实验条件下，mfp-3不加氧化剂的抗剪强度为0.94plusmn;0.33MPa，与未加氧化剂fp-3的抗剪强度有显著差异 (p＜0.1)(图3B)。

二羟基苯丙氨酸残基在内的分子间交联与50mM高碘酸盐诱导作为氧化剂,抗剪强度增加到2.28plusmn;0.41MPa,～2.4倍高于mfp-3没有氧化剂处理和～4倍高于比未改性fp-3 (p＜5times;10-5)。

图3 图4

4.3 几种多巴修饰重组图的体粘接强度比较

到目前为止，已有少量研究报道了map的整体黏附强度，包括重组fp-5、杂交型fp-131和fp-151。本文并非首次报道重组fp-3的体粘接强度。虽然重组fp-5、fp-131和fp-151的整体粘合强度值使用铝粘附体已经进行了报道，但是这些研究使用了不同的实验条件，难以进行直接比较。因此，在相同的实验条件下测量重组fp-5、fp-131和fp-151的整体粘合强度值，以便能够与重组fp-3直接比较。所有重组质粒都是在大肠杆菌中产生的(图4A)。重组fp-5 (～10.5 kDa)采用与fp-3相似的方法进行纯化。而重组fp-131 (～19.9 kDa)和fp-151 (～23.6 kDa)是杂交型蛋白质，则用乙酸盐提取法进行纯化。

所有重组MAPs按处理fp-3的方法，在体外用酪氨酸酶处理，最后制成DOPA修饰的冻干蛋白粉。多巴修饰通过NBT染色得到证实，所有多巴修饰的重组MAPs均显示清晰的蓝紫色斑点，而未修饰的MAPs未被染色(图4B)。多巴修饰的mfp-3、多巴修饰的重组fp-5 (mfp-5)、多巴修饰的重组fp-131 (mfp-131)和多巴修饰的重组fp-151 (mfp-151)的产量用IRPH分析定量(表2)。不同数量的酪氨酸残基、溶解度和不同的酪氨酸残基可及性可能导致不同的修饰产率。因为在本研究中没有考虑由酪氨酸酶形

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