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排水沟中不同氮源条件下微生物代谢反应及生态系统转化的机制
摘要：氮在下水道生态系统中起着核心作用，氮的生物转化能够显著影响着下水道中的生物反应。但是，氮相关污染物参与下水道生态系统的潜在机制仍然未知。在这项研究中，研究了两个典型氮比（有机/无机氮：7/3（A组）和3/7（B组））对下水道污水中碳、氮和硫生物转化的影响。氨基酸分布，例如脯氨酸，甘氨酸和蛋氨酸在A组和B组之间存在显着差异，并且碳相关群落（基于16S rRNA基因拷贝）在A组中更为普遍，而硫和氮相关群落在B组中更为普遍。为了探索氮对微生物响应机制的影响，使用宏基因组学的方法研究氨基酸在下水道中碳、氮和硫生物转化中的作用。A组中的脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸促进了与细胞膜运输相关的基因的表达，并提高了蛋白质合成的速率，从而刺激了碳相关群落的富集。B组中较高浓度的丙氨酸和蛋氨酸的跨膜运输对于细胞代谢和营养物质运输很重要，从而丰富了氮和硫相关的群落。在这项调查中，揭示了对下水道生态系统中的碳、氮和硫生物转化的见解，从而极大地提高了人们对下水道生态系统的了解。
1、介绍
城市下水道系统中的大量污染物是微生物群落的底物。污染物组成的变化会影响微生物群落的结构和代谢特征。城市污水的主要成分是碳、氮和硫。碳和硫相关污染物的生物转化会导致甲烷和硫化物的产生，除管道腐蚀外，所有这些都会影响城市下水道系统的稳定运行。先前对氮化学的研究主要集中在与硝酸盐或亚硝酸盐添加有关的过程上，以减轻下水道系统中甲烷和硫化物的产生，但是很少探讨污水中预先存在的氮污染物的转化及其对下水道系统的影响。
由于生活污水中含量丰富的蛋白质，尤其是厨房污水，下水道初期的生活污水中有机氮源含量最多（gt;总氮(TN)的50％）。然而，近几十年来，城市环境的规模逐渐扩大，越来越多的工业废水被引入城市下水道系统，包括畜牧业和制革废水，其中含有高浓度的无机氮，主要是氨，占总氮的80％以上。这些添加物增加了许多工业城市污水中无机氮的浓度。因此，在主要排放生活污水的城市和排放生活污水以及大量工业废水的城市之间，污水中有机氮和无机氮的比例存在显着差异。
氮源，尤其是氨基酸，是微生物群落中合成和分解代谢的核心物质。污水中有机氮和无机氮的比例会显着影响氨基酸的合成，从而影响微生物群落的合成和分解代谢。例如，不同比例的有机氮和无机氮会影响污水中甘氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸的转化。甘氨酸可以激活与细胞膜运输相关的基因，这种现象与碳相关的群落有关。蛋氨酸和半胱氨酸在硫相关的循环中起着重要的作用，并且可以诱导硫化物的产生。因此，氨基酸代谢形式的氮转化是碳和硫相关微生物群落的基石，污水中不同的氮条件可能会严重影响不良的过程，例如城市下水道系统中的硫化物生成和管道腐蚀。然而，在不同氮条件下，下水道系统中的氮转化还有待研究，并且氮污染物的不同组成对下水道系统运行的影响也需要进一步研究。
这项研究的目的是确定不同氮条件（较高浓度的有机氮或较高浓度的无机氮）对主要微生物群落（例如发酵菌(FB)，产氢的乙酸原(HPA)，产甲烷菌(MA)和硫酸盐还原菌(SRB)）的代谢的影响，以及下水道系统中的生态系统转化。在150天的时间里，在1200 m的试验污水系统中建立了两种污水氮条件（A组和B组）。在两个实验组中，监测了氨基酸水平的变化，并使用定量聚合酶链反应（qPCR）和16S rRNA基因扩增子测序鉴定了碳、氮和硫相关的群落的分布。为了产生一个概念性的下水道生态系统模型，以深入了解下水道中的重要运动，我们使用宏基因组学进一步探索了碳、氮和硫相关群落之间的功能潜力和代谢途径。由于氮的关键作用，可以研究下水道生态系统中碳、氮和硫生物转化之间的相互作用。因此，通过揭示下水道系统中不同氮素条件下氮转化的途径和机理，这项研究有助于提高分析和不良过程预测（如硫化物生成和管道腐蚀）的理论基础，并提高对城市下水道系统中微生物群落内生态系统的理解。
- 材料和方法
2.1 下水道系统设置
在中国西安第五污水处理厂建造了有效长度为1200 m的模拟试点污水系统。实际的城市下水道系统的关键操作参数是温度，溶解氧，管道坡度，流速和管道直径。在这项研究中，使用电热水龙头（TCL，TDR-30JB02）将进水温度控制在20-25°C。为了确保管道系统内部的温度恒定，用海绵材料（20毫米）覆盖管道外部。溶解氧（DO）浓度为0.3plusmn;0.05 mg / L。驱动污水流的力是重力。管道的坡度为5permil;，在这些条件下可以保持0.6 m / s的流量。一层防光绝缘材料包裹在管道上，以模拟真实下水道的黑暗环境。所有的参数都非常接近真实的下水道。
为了模拟下水道中的长距离污染物转化，减小 管径以充分利用试验现场的优势。为了确保先导下水道与实际下水道之间的流量均匀，使用小口径管内壁研磨机研磨先导管的内壁，以达到与实际下水道相对应的粗糙度。该设备包括一个可伸缩的10 m长连杆，一个钢丝刷，一个可连接至磨头和叶轮轴的电钻卡盘。使用便携式粗糙度测量仪（MarSurf M300C，德国）测量粗糙度。粗糙度（Ra）值为3.2 um，与先前报道的测量结果一致。本研究中的合成污水定期更新一天。试点污水系统如图S1所示。
2.2 氮源条件的变化
由于厨房垃圾中的蛋白质含量较高，可能占干重的11％至28％，因此在主要排放生活污水的城市中，污水中的有机氮可占TN的50％至80％。随着城市规模的扩大，越来越多的工业废水，如畜牧和制革废水，含有很高浓度的无机氮，主要是氨氮，这些无机氮占据总氮的80％以上，被收集到城市下水道系统中。因此，对于排放生活污水和大量工业废水的城市，污水中的无机氮占总氮的60％以上。如上所述，有两种典型的污水，一种是有机氮含量较高（TN的50％至80％），另一种是无机氮含量较高（TN的60％以上）。为了探索不同氮源组成对碳和硫相关生物转化的影响，选择了两种配比的有机和无机氮源（A组中的7：3和B组中的3：7）研究（表S1）。两组的其他水质特征相同（表S2）。对于废水采样，从排水系统的检查井收集样品，以检测水质。
2.3 环境因素分析
使用尖端直径为10mu;m的微电极（丹麦Unisense）测试生物膜的厚度，pH，DO和氧化还原电位（ORP）。微电极平台包含两个部分，分别用于测试和生产。信号由主机收集，并由计算机自动读取。在测量期间，将鼓泡有N2的超纯水用作基础液，并使用尼龙网固定生物膜。采样时间分别为实验过程的第5天，30天，60天，75天，90天和150天。
2.4 氨基酸检测
将水样品用异硫氰酸苯酯（PITC）衍生化。将样品均匀混合，并使其在室温下静置一小时。随后，添加800mu;L正己烷，并将混合物以10000r / min的速度离心5分钟以吸收下层。将该溶液用正己烷萃取两次，并通过0.45mu;m的过滤器过滤。样品预处理后，使用高效液相色谱仪（LC-10A，日本）。柱为Hypersil BDS C18（250 mmtimes;4.5 mm，5mu;m）。流动相A为50 mmol/L醋酸钠溶液，流动相B为甲醇、乙腈和水溶液(30:50:20)的混合物。线性梯度洗脱程序如下：0分钟，0％B；6.5分钟，0％B；7分钟，10％B；8分钟，12％B； 9分钟，13％B；10分钟，13％B；14分钟，14％B; 15分钟，15％B；20分钟，20％B；24分钟，35％B；25分钟，36％B；27分钟，36％B；28分钟，40％B；30分钟，45％B；35分钟，60％B；35分钟，60％B；50分钟，10 0％B。流速为1.0 mL / min。柱温为40℃。检测波长为254nm。进样量为5mu;L。采样时间为实验过程的第150天。
2.5 生物膜采样和厚度检测
为了培养生物膜，将3.0米长的条形玻璃杯放置在试验下水道的管道内。可以解开管道末端的两个活结以取出玻璃杯，并在取样时，用无菌玻璃刀切下约30厘米长的条形玻璃杯，并将其放入一次性培养皿中。该操作避免生物膜结构的破坏，从而允许使用微电极（丹麦Unisense）分析生物膜的厚度。采样时间为实验过程的第150天。
2.6微生物群落的表征
2.6.1 DNA提取
为了确定微生物群落的特征，收集了22个生物膜样品。对16个样品进行16S rRNA基因检测，并被分为A和B两组。其余6个样品进行宏基因组检测，并被分为A和B两组。根据制造商的说明，使用CTAB / SDS方法从样品中提取基因组DNA。使用微分光光度法测定DNA浓度和纯度。最后，该样品用于Illumina高通量测序（HTS）。
2.6.2 高通量测序
高通量基因测序被用于鉴定数百种不同类型的细菌、真核生物和古细菌的相对丰度差异。这些样品被送到Novogene研究所（中国北京），通过HiSeq 2000平台进行高通量测序（美国，依诺米那）。使用依诺米那PE150进行超基因组测序。
2.6.3 定量聚合酶链反应
使用应用生物系统7500 qPCR系统（应用生物系统，福斯特城，CA）进行定量聚合酶链反应分析，每个测试重复三遍。在不同菌株中扩增16S rRNA基因的V3和V5区的正向和反向引物是：DNB，F（ATYGGCGGVCAYGGCGA）和R（GCCTCGATCAGRTTRTG-GTT）；HPA，F（GTWTGGGCWAARGGYGGM- GAAGG）和R（GTATTGDGTYTTRGCCATACA）（Xu，2010）； SRB，F（CGGCGTTGCGCATTTYCAYACVVT）和R（GTGGMGCCGTGCATGTT）；MA，F（TTCTATGGTTACGACTTVCAGGACCART-GYGG）和R（TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT）；AOB，F（GGGGTTTCTACTGGTGGT）和R（CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC）；总细菌（TB），F（ACTCCTACGGGAGGCGC）和R（GACTACCAGGGTATCTAATCC）。
2.7 生物信息学分析
使用QIIME软件对原始序列数据进行质量校准。移除标签和引物来形成读段，并使用UCLUST基于97%的相似性将读段聚为操作分类单元(OTUs)。采用OTU分析方法测定样品中不同微生物的多样性和丰度。对alpha多样性的评估主要基于Chao1，Shannon指数和Good的报道。使用Chao1 / Ace估算微生物群落的丰富度，并根据Simpson / Shannon指数评估多样性。 Beta多样性和主成分分析（PCA）用于评估样品中微生物群落的差异。
3、结果与讨论
3.1 下水道中不同氮条件下氨基酸的变化
在这项研究中，环境因子（pH，DO和ORP）和A和B组中生物膜的厚度在第75天时趋于稳定（图S2-4），这与以前的研究相似。此外，我们以前的研究表明，下水道生物膜中的微生物群落结构在第90天时趋于稳定。因此，在本研究中，采样时间为第150天，以确保生物膜的完全稳定性。但是，A组和B组中生物膜的形式在成熟时是不同的。沿下水道，A组生物膜的厚度明显大于B组（图1a），这可能是由于两组微生物繁殖的特征不同。为了探索这一假设，对下水道沿线的氮相关污染物进行了调查。如图1b所示，两个实验组中的氨（NH4 -N）逐渐增加，这可能是由于污水中的微生物优先利用了有机蛋白质，然后将其水解为NH4 -N。硝酸盐（NO3--N）的浓度呈下降趋势，在400m后几乎消失（图1b）。两组中无机氮的变化相似，如先前的研究表明，污水中无机氮的转化强度较低。确定了参与蛋白质合成的主要氨基酸的分布（图1 c-d）。两组之间的氨基酸组成明显不同。A组中有16种不同的氨基酸，而B组中只有13种。A组中的特定氨基酸包括脯氨酸，甘氨酸和酪氨酸。在B组中，丙氨酸是唯一的。此外，两组中共存优势氨基酸的丰度存在显着差异。 A组和B组的蛋氨酸丰度分别为32.67％和66.24％，A组和B组的苏氨酸丰度分别为29.86％和6.50％（表S3）。因此，可以得出结论，氮源条件的变化会导致下水道中氨基酸的不同分布。应该注意的是，尽管A组和B组的碳源条件相同，但A组和B组中的小分子碳污染物（如乙醇，乳酸，甲酸和乙酸）的变化显示出显着差异（如图S5所示）。在A组中检测到较高浓度的微分子碳污染物。碳污染物的转化是下水道系统中的主要生物反应，本研究中微分子碳污染物的不同变化特征表明不同的氮源条件可能会影响下水道系统中污染物的转化过程。先前的研究表明，底物和微生物群落的分布具有协变关系，并且主要的生物反应沿下水管道变化；因此，A组和B组之间氨基酸的变化也可能影响下水道中微生物的代谢过程。
3.2 不同氮条件下功能微生物的分布特征
3.2.1 A和B组中的微生物群落结构概述
如表S4所示，A组和B组的Shannon指数的峰值分别为8.58和8.11，表明A组中微生物群落的多样性高于B组。在主成分分析（PCA）图中，beta;多样性表明，A组和B组之间的微生物群落组成也显著不同（图2）。该观察结果表明氮源影响了微生物群落的整体繁殖。为了确定氮源对微生物群落分布的影响，使用16S rRNA基因测序对生物膜样品的序
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