橙皮素是一种柑橘类黄酮，通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡来减轻糖尿病大鼠的睾丸损伤。外文翻译资料

 2022-08-08 11:30:56

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文献翻译

橙皮素是一种柑橘类黄酮，通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡来减轻糖尿病大鼠的睾丸损伤。

摘要：

目的：

本研究旨在评估橙皮素对糖尿病大鼠睾丸损伤的有益作用。主要方法:用链脲佐菌素(60毫克/千克，口服)诱导糖尿病后10天开始用橙皮素口服治疗46天。除了评估附睾精子数量、活力和生存力外，还通过对生精小管的组织学评估来评估睾丸损伤。除此之外还测定了凋亡、炎症和氧化应激的睾丸生物标志物。

主要发现:

糖尿病组的橙皮素治疗除了改善血清睾酮外，还防止体重减轻以及降低血清葡萄糖。此外，另外，橙皮素治疗的糖尿病组氧化应激和凋亡的特异性生物标志物、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、蛋白质羰基、DNA片段化和caspase3活性水平较低。此外，橙皮素增强了睾丸抗氧化系统，表现为谷胱甘肽(GSH)、线粒体膜电位(MMP)和铁还原抗氧化能力(FRAP)水平较高，此外还改善了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。此外，橙皮素增强了睾丸抗氧化系统，表现为谷胱甘肽(GSH)、线粒体膜电位(MMP)和铁还原抗氧化能力(FRAP)水平较高，还改善了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。此外，对糖尿病大鼠施用橙皮素减弱了由肿瘤坏死因子 (TNF)和白细胞介素17 (IL17)组成的睾丸炎症指数，并防止了曲细精管的损伤，如糖尿病大鼠中更高水平的精子计数、活力和存活力所揭示的。

意义:

总的来说，橙皮素除了上调内源性酶和非酶抗氧化物外，还可以通过抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症来减轻糖尿病对睾丸的损伤。

关键词:橙皮素，糖尿病，睾丸，凋亡，炎症，氧化应激

1.引言

糖尿病是一种常见的内分泌疾病，在世界范围内引起广泛关注，2008年约有3.47亿人患病，预计到2050年，其发病率将增加约两倍。长期糖尿病，无论其类型如何，都伴随着氧化应激负荷的增加，炎症和凋亡。此外，慢性糖尿病会对男性生殖器组织造成有害影响，导致睾丸损伤、精子发生异常、性功能障碍甚至不孕等并发症。

橙皮素(3rsquo;，5，7-三羟基-4rsquo;-甲氧基黄烷酮，C16H14O6)是一种天然黄烷酮和橙皮苷的苷元，在柑橘类水果中发现，在人类疾病的各种实验模型中具有多种有益效果，其具有抗氧化作用、抗炎作用、抗凋亡作用]以及化学预防作用和抗癌特性。橙皮素在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠中显示出抗高血糖、抗高血脂和抗氧化作用，并且能够抑制糖尿病大鼠的视网膜氧化应激、神经炎症和细胞凋亡。此外，橙皮素可以保护大鼠免受镉诱导的睾丸氧化功能障碍并通过抑制炎症和凋亡介质（包括NF-kappa;B和caspase 3）显示对阿霉素诱导的大鼠睾丸损伤的保护作用。本研究旨在评估橙皮素对STZ糖尿病大鼠睾丸损伤的保护作用，并确定氧化应激、炎症和细胞凋亡的可能参与。

2.材料和方法

2.1.动物

在本研究中，32只雄性Wistar大鼠(10-12周龄，体重范围为185-240克)被保存在沙希德大学(伊朗德黑兰)的动物设施中，温度为22-24℃，光照/黑暗周期为12/12小时。食物和水是随意给动物的。在进行任何实验之前，这些大鼠至少适应了一周的居住条件。所有老鼠都按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的标准进行了测试，我们的项目也于2016年获得了沙希德大学伦理委员会的批准。

2.2实验策略

将大鼠随机分为四个相同大小的组(每组8只)，包括对照组、橙皮素治疗的对照组、糖尿病组和橙皮素治疗的糖尿病组。对照组的大鼠每天接受媒介物。大鼠通过腹腔注射STZ（Santa Cruz Biotechnology，USA）制成糖尿病模型，剂量为60 mg/kg；）制备于冷生理盐水中，pH调节至4.5。注射STZ后10天，从大鼠（在乙醚麻醉下）采集隔夜空腹血样，并使用ParsAzmun公司（德黑兰）的葡萄糖测定试剂盒测定血糖水平。将血糖高于250 mg/dl的大鼠视为糖尿病大鼠，并选择其进行进一步研究。橙皮素治疗的对照组接受橙皮素(SigmaAldrich，美国)口服，使用灌胃针，剂量为50毫克/千克/天。将橙皮素溶解在Kolliphor El(SigmaLDRICH，美国)中，并使用涡旋混合器溶解。STZ注射后10天开始进行橙皮素治疗，并持续46天。橙皮素的剂量是根据早期关于其对大鼠卵巢缺血-再灌注损伤的保护作用的研究和其对多柔比星诱导的大鼠氧化应激和DNA损伤的心脏保护作用的研究。每周监测体重，并在STZ注射前一周以及STZ后第4周和第8周测定血清葡萄糖水平。

2.3生化研究

在注射STZ后第8周末，通过心脏穿刺从乙醚麻醉的大鼠收集血液后，根据试剂盒说明(美国开曼化学公司)用睾酮酶联免疫试剂盒测定血清睾酮水平。此外，分离右侧睾丸，清除多余组织，称重，用冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）清洗，并在冰冷Tris–HCl缓冲液（150 mM，pH 7.4）中均质化。所得匀浆在4℃下以5000 rpm离心10 min。

2.3.1.氧化应激和抗氧化评估

使用硫代巴比妥酸法测定组织中的丙二醛水平，并报告为以四乙氧基丙烷为标准的每毫克蛋白质中的丙二醛含量。

抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性是根据以前的报告测定的。简言之，将上清液与黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶在磷酸钾缓冲液中放置40分钟，并加入硝基蓝四唑鎓(NBT)。在550nm处监测蓝色甲赞的形成。

过氧化氢酶的活性是根据克莱本的方法测定的。将过氧化氢加入50 mM磷酸钾缓冲液和上清液的混合物中，并在240 nm处测量其分解速率。

谷胱甘肽（GSH）水平的测定与先前的报道一致。简言之，用三氯乙酸离心匀浆，并将获得的上清液与磷酸盐缓冲液和55二硫代（2-硝基苯甲酸）混合，在412nm处读取吸光度。

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的测量是根据帕格利亚和瓦伦丁的方法进行的，只需稍加修改([34)。为此，在365纳米处测量H2O2、还原型谷胱甘肽、NADPH、叠氮化钠和谷胱甘肽还原酶存在下的吸光度变化。

以牛血清白蛋白为标准，采用布拉德福法测定蛋白质含量。

铁还原抗氧化能力（FRAP），也称为总抗氧化能力（TAC），是用Benzi和Strain的方法测定的。在本试验中，将新鲜制备的FRAP试剂与组织上清液混合。在37℃放置15min后，获得吸光度的变化。

如前所述，测量作为蛋白质氧化有效指标的总蛋白质羰基含量。组织匀浆离心在10000 g下放置20分钟，分离细胞溶质部分，并将该部分添加到等比例的TCA。此后，添加二硝基苯肼（DNPH）并将其溶解后室温下保存60分钟。用乙醇-乙酸乙酯混合物洗涤沉淀三次，加入盐酸胍溶解沉淀，在366 nm处读取其吸光度。

用非荧光物质二氯荧光素二乙酸酯评估活性氧的估计水平，二氯荧光素二乙酸酯在活性氧存在下被细胞内酯酶切割成发出荧光的2，7-二氯荧光素。在488纳米激发和525纳米发射下测量荧光。使用二氯荧光素构建标准曲线。

2.3.2.凋亡评估

Caspase 3的活性是根据对硝基苯胺(pNA)的水解和早期的一项研究来测定的。将20mu;l组织匀浆与测定缓冲液(50 nmol/L HEPES，pH 7.4，0.2% CHAPS，20%蔗糖，2 mmol/L乙二胺四乙酸，10 mmol/L二硫苏糖醇，和50 mu;mol/L显色pNA特异性脱辅基底物(Z-Asp-IH-Val-Asp-pNA))在37℃孵育。在450 nm处测量释放的显色pNA的量，并将值表示为OD。此外，使用细胞死亡检测试剂盒(罗氏诊断公司，德国)测量作为细胞凋亡的可靠指标的DNA断裂强度。

2.3.3.线粒体膜电位

为了测量基质金属蛋白酶，上清液以10，000转/分钟离心15分钟。沉淀物包含来自睾丸组织的线粒体部分。对基质金属蛋白酶变化的评估与之前报道的一样。将获得的线粒体与0.2 mol/l的罗丹明123(sigma ldrich，USA)在37℃孵育5分钟，然后在488 nm激发和525 nm发射后测量基质金属蛋白酶，最后报告荧光强度。

2.3.4.炎症评估

分别使用sigmaaldrich(美国)和Abcam(美国)的酶联免疫吸附试验测定TNF和IL-17A的睾丸水平。样品的吸光度在450纳米处由协同高温微孔板读数器(美国毕奥泰克)读取，其最终浓度由相关标准曲线获得。

2.4.精子参数评估

这个实验的方案以前已经报道过。在这方面，进行剖腹手术，分离附睾尾，切碎，并在含有林格氏溶液(37℃)的预热培养皿中孵育。20分钟后，取出附睾尾，轻轻摇动悬浮液至均质。然后，将15 mu;l精子悬液放在血细胞计数器载玻片上，并计数沉淀的细胞。精子计数并报告为百万/毫升。通过在37℃的载玻片上观察20 mu;l精子悬液来进行运动性测定。通过随机计数10个区域中的100多个精子来确定活动精子的百分比，计算出向前运动精子的平均数times;100/精子总数。用伊红-黑色素染色法测定精子活力。在对总共100个细胞中活的和不活的精子进行计数后，以百分比的形式获得存活率。

2.5.组织学研究

为了进行组织学评估，将左侧睾丸固定在10%磷酸盐缓冲福尔马林溶液中3天，并进行常规光镜分析。将睾丸切片，厚度为5微米，用苏木精和伊红染色，脱水，清除，最后用恩替兰(德国默克公司)固定并盖片。至少，对睾丸上部、下部和中部的3张载玻片进行了全面评估。为了评估睾丸和精子发生损伤，使用了约翰逊的平均睾丸活检评分(MTBS)。在这方面，每个生精小管的评分为0-10，表明生发上皮成熟的水平。定量分析采用Image J软件(1.49版)。

2.6.统计分析

所有获得的数据以扫描电镜的方式显示。使用SigmaPlot软件(版本12)进行统计分析。组间比较通过参数单因素方差分析进行，然后进行图基事后多重比较试验。显著性水平设定为plt;0.05。

3.结果

3.1.橙皮素对体重及血清葡萄糖和睾酮水平的影响

在第0周(糖尿病诱导前两天)，各组之间在体重和血清葡萄糖水平方面没有统计学上的显著差异。相比之下，在糖尿病诱导后第8周，糖尿病组的体重比相同组的第0周显著降低(plt;0.01)。与糖尿病组相比，用橙皮素治疗的糖尿病大鼠没有表现出体重的显著降低，并且该参数在第8周甚至显著更高(plt;0.05)。此外，糖尿病组和橙皮苷治疗组在第4周和第8周的血糖水平明显高于第0周(plt;0.001)。然而，与糖尿病组相比，用橙皮素治疗的糖尿病大鼠的血清葡萄糖水平显著降低(plt;0.05-0.01)。

与对照组相比，糖尿病大鼠的血清睾酮也显著降低(plt;0.001)。用橙皮素治疗糖尿病大鼠可显著防止糖尿病引起的血清睾酮降低(plt;0.05)。同时对照组和用橙皮素处理的对照组在这方面没有显著差异。

3.2.橙皮素对睾丸氧化应激指标和抗氧化剂的影响

随着糖尿病的发展，氧化应激增加，酶和非酶抗氧化系统受到抑制，此外，线粒体完整性受到干扰，睾丸组织随之受损。在此基础上，我们评估了除线粒体膜电位外的睾丸氧化应激参数。在这方面，糖尿病大鼠的丙二醛(plt;0.001)、活性氧(plt;0.001)和蛋白质羰基(plt;0.001)水平明显较高。此外，糖尿病组的MMP (plt;0.01)、FRAP (plt;0.001)、GSH (plt;0.001)、SOD(p lt; 0.001)、过氧化氢酶(plt;0.01)和GPx(p lt; 0.001)活性显著降低。相反，给予糖尿病大鼠橙皮素显著逆转了丙二醛(plt;0.05)、活性氧(plt;0.01)、蛋白羰基(plt;0.05)、基质金属蛋白酶(plt;0.05)、纤维结合蛋白(plt;0.01)、谷胱甘肽(plt;0.05)、超氧化物歧化酶(plt;0.01)、过氧化氢酶(plt;0.05)和谷丙转氨酶(plt;0.01)的不适当变化。此外，与对照组相比，用橙皮素治疗的对照组的这些指标没有显著变化。

3.3.橙皮素对睾丸细胞凋亡指标的影响

糖尿病状态下细胞凋亡发生的强度更高。为此，我们测定了睾丸组织中细胞凋亡的一些相关指标，包括DNA片段化和caspase 3活性。在这方面，STZ糖尿病大鼠有明显更大的脱氧核糖核酸断裂(plt;0.001)和caspase 3活性(plt;0.001)。相反，用橙皮素治疗糖尿病大鼠显著逆转了DNA断裂(plt;0.05)和caspase 3 (plt;0.05)的不适当变化。与对照组相比，用橙皮素治疗的对照组的这些指标没有显著变化。

3.4.橙皮素对睾丸炎症指标的影响

糖尿病个体的男性生殖组织[49]和糖尿病动物模型中的炎症显著增强。为此，我们测量了包括TNF和 IL-17在内的一些睾丸炎症指标。在这方面，与对照组相比，糖尿病组具有显著升高的TNF水平(plt;0.001)(图5A)和IL-17水平(plt;0.001)。与糖尿病组相比，给予橙皮素后，糖尿病大鼠的TNF (plt;0.01)和IL-17 (plt;0.05)水平显著降低。此外，在用橙皮素治疗的对照组中，没有发现与这些炎症生物标志物相关的显著变化。

3.5.橙皮素对精子参数和睾丸组织学的影响

在这方面，STZ糖尿病组与对照组相比，实验组的精子计数（plt;0.001）、精子运动能力（plt;0.001）和精子生存能力（plt;0.001）显著降低。此外，与糖尿病组相比，橙皮素治疗组的精子计数、活力和生存能力均显著提高（plt;0.05）。

睾丸组织的组织学分析表明，ST

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