用重组大肠杆菌全细胞催化高效合成丁二胺外文翻译资料

 2022-08-08 15:16:23

英语原文共 7 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

用重组大肠杆菌全细胞催化高效合成丁二胺

ABSTRACT：丁二胺是一种工业价值很高的胺。目前，工业上使用的化工生产方法存在着使用不可持续的石油原料和昂贵的反应催化剂、使用易燃易爆原料和反应过程不安全等缺点。因此，研究人员将注意力转向丁二胺的生物合成。大肠杆菌具有合成丁二胺的天然途径，是产生丁二胺的理想宿主菌。本研究通过在工程化大肠杆菌PUT2中过表达两种关键途径酶，结合良好的发酵控制策略，构建了一个有效的丁二胺生物生产平台。大肠杆菌PUT2在48h内将精氨酸转化为丁二胺，效价为26.21g Lminus;1，单位生物量的丁二胺比产量为1.99g，产率为0.54g L-1h-1，获得了较高的细胞生产效率。与原大肠杆菌BL21（DE3）相比，丁二胺效价提高了79倍。本研究为丁二胺生物合成提供了一种有前景的策略，为大规模丁二胺生物生产奠定了基础。

KEYWORDS：丁二胺，大肠杆菌BL21（DE3），全细胞生物转化，ADC通路过表达，发酵

INTRODUCTION：

丁二胺，又称1，4-二氨基丁烷，是真细菌和古细菌中常见的二胺[1]，对细胞生长有重要影响[2]。由于其巨大的工业价值[3]，天然丰富的丁二胺受到了极大的关注。丁二胺被广泛用于生物塑料、杀菌剂和表面活性剂的工业生产[4,5]。其中，尼龙-4,6是丁二胺与己二酸缩聚反应最值得注意的应用。尼龙4,6作为一种高性能聚酰胺，由于其优异的耐磨性、耐热性、高刚度和良好的疲劳强度，被应用于工业机械、汽车制造、航空航天、电子配件、纺织服装等领域[6,7]。到2006年，欧洲丁二胺的年产量约为10000吨，估计每吨价值超过1600欧元[8,9]，预计还会增长[10]。

目前工业用丁二胺的合成主要依靠化学方法。首先，丙烯腈和氢氰酸在碱性催化剂作用下得到丁二腈（SCN），然后通过加氢反应将SCN转化为丁二胺[10]。不幸的是，这条路线的原材料是不可再生的石油产品，生产是不可持续的。同时，化学反应的控制条件相对严格，催化剂价格昂贵。因此，人们将注意力转向丁二胺的生物合成，希望通过微生物发酵将葡萄糖等可再生原料转化为丁二胺。大肠杆菌（E.coli）和谷氨酸棒状杆菌（C.glutamicum）已被广泛应用，并被研究人员改造以生产丁二胺[11]。Qian等人通过消除丁二胺代谢途径，增加前体鸟氨酸的积累，过度表达鸟氨酸脱羧酶，破坏整体应激调节因子RPO来提高菌株性能，构建了大肠杆菌工程菌株，最终菌株可产生1.68 gsdot;Lminus;1的丁二胺[10]。Wendisch等人通过外源表达大肠杆菌ODC途径的编码酶基因，构建了谷氨酸梭菌的丁二胺合成途径。之后，他们删除了argF（鸟氨酸转氨酰酶基因）和argR（L-精氨酸阻遏基因）以增加丁二胺前体鸟氨酸的供应，当提供20 gsdot;Lminus;1纯甘油和10 mM葡萄糖时，菌株产生0.85 gsdot;Lminus;1丁二胺[12]。然而，到目前为止，生物丁二胺的效价还远远不足以工业化生产[13]。

与葡萄糖从头合成丁二胺相比，以氨基酸为反应底物可以缩短转化路径，提高转化效率。本研究旨在建立以大肠杆菌BL21（DE3）为生物催化剂的丁二胺全细胞生物转化系统。以精氨酸为前驱体合成丁二胺，缩短了酶催化步骤，实现了丁二胺的高效积累。

Materials and methods:

2.1. 试剂和仪器

盐酸丁二胺（PUT）标准品购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。作为内标物的1-6-己二胺盐酸盐（HEX）和1,7-庚二胺（HEP）分别由Macklin（中国上海）和Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供。以阿拉丁（中国上海）的丹磺酰氯（Dns-Cl）为衍生试剂。HPLC级乙腈（ACN）购自Macklin（中国上海）。

高效液相色谱系统（安捷伦1260 InfinityⅡ，美国加利福尼亚州圣克拉拉）配备了安捷伦1260 VWD检测器（G7114A）和安捷伦折射率（RI）检测器（G7162A）。还应用了安捷伦1260小瓶取样器（G7129A）和安捷伦1260 Quat泵VL（G7111A）。在安捷伦的porpshell 120 EC-C18柱（4.6times;150thinsp;mm，粒径4thinsp;mu;m）和Bio-Rad的HPX-87H有机酸柱（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）上进行分析。

使用Waters-MALDI SYNAPT Q-TOF MS、Waters Acquity HPLC色谱仪和PDA检测器（200minus;500thinsp;nm）分析发酵液样品。样品在BEH C18柱（2.1times;times;150thinsp;mm，1.7thinsp;mu;m）上，45°C下分离，流动相A和B为乙腈（100%）和甲酸（0.1%）。流速为0.3thinsp;mL minminus;1，梯度洗脱程序如表S1所示。其他参数的设置方式与参考文献[14]中的相同。

2.2. 菌株

表S2列出了本研究中使用的菌株。丁二胺产生菌在添加葡萄糖（8thinsp;g·Lminus;1）和精氨酸（12thinsp;g·Lminus;1）的超优肉汤（SOB）上生长，置于250thinsp;mL摇瓶中。SOB的培养基配方为酵母膏、蛋白胨、KCl、NaCl和MgCl2。精氨酸作为一种碱性氨基酸的加入需要盐酸在使用前将pH调节到中性。用终浓度为1mm的IPTG（异丙基-beta;-D-硫代半乳糖苷）诱导基因表达。细胞培养在37°C和200thinsp;rpm搅拌下进行。发酵实验分三次进行。

2.3. 分析方法

采用坂口试剂法测定精氨酸的浓度，用分光光度计测定520thinsp;nm（OD520）。用Dns-Cl柱前衍生的高效液相色谱（HPLC）对丁二胺进行定量。培养液样品在12000 rpm下离心8thinsp;min，去除细胞，以5mu;LHEX（10thinsp;g·Lminus;1）和5thinsp;L HEP（10thinsp;g·Lminus;1）为内标，与样品500thinsp;mu;L上清液混合。Dns-Cl[15]衍生二胺的操作如下：将样品500thinsp;L与500mu;L饱和NaHCO3混合，饱和NaOH调节至pH 10，然后加入衍生试剂Dns Cl（1.0thinsp;mL，5thinsp;mgthinsp;mLminus;1，溶解于丙酮中）。混合物在黑暗中用60°C水浴加热30thinsp;min，然后，使用2thinsp;mL乙醚萃取10thinsp;min，收集上层有机层。最后一步共重复两次。萃取液经氮气混合干燥，除去乙醚。然后将衍生反应溶解于500mu;L乙腈溶液（流动相），用0.22mu;m滤膜过滤，进一步检测。在C18分析柱上进行丹酰二胺的HPLC分离，并保持在30°C，紫外检测波长设置为254thinsp;nm。注射量为10mu;L，以0.22mu;m滤膜过滤的超纯水和高效液相色谱级ACN作为流动相A和B。梯度洗脱程序设置为0minus;4thinsp;min，55%–70%B；4–6.7thinsp;min，70%B；6.7minus;12thinsp;min，70–95%B；12–12.6thinsp;min，95%B；12.6–13.5thinsp;min 95minus;55%B；13.5minus;16thinsp;min 55%B，总流速为0.7thinsp;mL/min。经校准曲线[16]标定后，得到丁二胺效价。用高效液相色谱法在有机酸柱上用RI检测器测定葡萄糖、乙酸和乳酸。流动相采用5thinsp;mM硫酸，流速为0.3thinsp;mL/min[17]。

2.4. 质粒构建

以PCOLADEOUT-1（低拷贝）、pETDuet-1（中拷贝）和pRSFDuet-1（高拷贝）为载体，分别构建重组质粒pJN1、pJN2和pJN3，以表达ADC途径中的基因speA（精氨酸脱羧酶）和speB（胍丁胺酶）（图1）。本研究中使用的质粒和引物列于表S2和S3中。分别用引物speA-F（Nco I）、speA-R（EcoR I）和引物speB-F（Nde I）、speB-R（Xho I）从大肠杆菌K-12 MG1655基因组中扩增出speA和speB。通过酶切（NcoⅠ、ecori、NdeⅠ、Xho I）和T4-DNA连接酶，将PCR产物speA和speB依次插入质粒pCOLADuet-1中。获得重组质粒pJN1。所需质粒通过克隆PCR和Sanger测序验证引物[14,18]。用前面提到的相同方法构建了pJN2和pJN3质粒。

图1：大肠杆菌中丁二胺合成和代谢的相关途径。

2.5. SDS-PAGE电泳

在发酵过程中，诱导12小时后收集细菌。用50thinsp;mmol·Lminus;1 Tris-HCl（pH 7.4）洗涤两次后，将每个菌株培养物的最终OD600稀释至1，用于SDS-PAGE凝胶分析。细胞在冰上超声处理10thinsp;min，并在12000thinsp;rthinsp;minminus;1下离心3thinsp;min。上清液按比例加入缓冲液。沸水浴10分钟后，在12000thinsp;rthinsp;minminus;1下离心3分钟，在10%SDS-PAGE凝胶上分离上清液。

2.6. 体外酶催化

在发酵过程中，诱导12小时后收集细菌。用50mmol·L-1 Tris-HCl（pH7.4）洗涤两次后，将每种菌株培养物的最终OD600稀释至相同。将细胞在冰上超声处理10分钟，并以12000转/分钟离心3分钟。上清液用作粗酶溶液。体外酶促反应体系如表S4所示。将除粗酶溶液外的组分在37℃下预热10分钟，最后加入粗酶开始反应。使用200mu;L40%三氯乙酸以精确反应10分钟终止反应。在10000转/分钟离心10分钟后，将上清液衍生化并用于HPLC以确定丁二胺的产生。

Results and discussion:

3.1. 确定起始菌株的生产能力

利用丁二胺合成的天然途径，选择大肠杆菌BL21（DE3）进行丁二胺生产的发酵实验。E、 通过用SOB培养基摇瓶发酵，大肠杆菌BL21（DE3）在24小时内产生0.33g·L-1丁二胺（图2A）。通过LCMS-Q-TOF进一步鉴定大肠杆菌BL21（DE3）的发酵液样品（图2B）。PUT标准MS/MS谱具有前体离子[m H] 89.1的m/z信号和碎裂产物离子m/z 72.1[19]。后者的形成是由于末端中性氨分子（m/z[m H-NH3] ）的损失[20]。同时，在发酵液样品中发现了相同的片段，质子化分子离子[M H] 89.1和产物离子M/z 72.1，这进一步证明了大肠杆菌菌株产生的丁二胺。

图2：BL21（DE3）在SOB培养基中产生丁二胺及LC-MS分析。（A） 菌株大肠杆菌BL21（DE3）的丁二胺生产；（B）大肠杆菌BL21（DE3）在SOB培养基中产生的丁二胺的质谱图。该图显示了PUT的选定离子色谱图（质子化分子[M H] 89.1和产物铁M/z 72.1）。

3.2. 验证ADC途径中的酶活性

在大肠杆菌中合成丁二胺有两种途径：通过鸟氨酸脱羧酶从鸟氨酸直接合成丁二胺的ODC途径和通过精氨酸脱羧酶和胍丁胺酶从精氨酸通过胍丁胺合成丁二胺的ADC途径[5]。在这项研究中，考虑到两种前体精氨酸和鸟氨酸的价格，选择ADC途径进行改进，旨在提高大肠杆菌生产丁二胺的能力。首先，ADC途径中的酶用于体外将精氨酸转化为丁二胺。细胞破碎后获得粗酶溶液。每20分钟取样一次，以确定样品中精氨酸生物转化的丁二胺浓度。结果如图3所示，120分钟后，丁二胺滴度几乎稳定，精氨酸产生0.19 g·L-1丁二胺。

图3：验证ADC途径中的酶活性。

3.3. 过度表达的ADC途径的影响

据报道，载体的拷贝数与靶片段的复制效率密切相关[18]。具有较高拷贝数的表达载体可以更有效地表达靶基因并增加靶蛋白的表达。因此，我们试图通过增加表达载体的拷贝数来提高丁二胺的滴度。speA和speB基因在来自低拷贝质粒pJN1，中拷贝质粒pJN2和高拷贝质粒pJN3的T7启动子下表达。分别使用这三种质粒构建三种重组菌株PUT1，PUT2和PUT3。三种重组菌株和原始菌株的发酵在SOB培养基中进行（图4）。PUT3（pJN3）产生1.80g·L-1的丁二胺，与原始菌株BL21（DE3）没有显着差异。另一方面，与原始菌株BL21（DE3）相比，PUT1（pJN1）和PUT2（pJN2）菌株显示出阳性变化。PUT1（pJN1）菌株的丁二胺产量最高为2.91g·L-1（约为原始菌株的1.8倍），PUT2（pJN2）菌株的丁二胺产量为3.94g·L-1（约为原始菌株的2.4倍）。

图4：通过具有过表达ADC途径的重组大肠杆菌BL21（DE3）产生丁二胺。含有低拷贝质粒pJN1的重组菌株PUT1。含有中拷贝质粒pJN2的重组菌株PUT2。含有高拷贝质粒pJN3的重组菌株PUT3。BL21（DE3）是原始菌株。不同的字母（a，b和c）表示显着差异（Plt;0.05）。

接下来，分析speA（73.8kDa）和speB（33.6kDa）的蛋白质表达（图5A）。speA和speB的表达在不同的质粒系统上变化。发现PUT2（含有中拷贝质粒pJN2）中speA和speB的表达在三种重组菌株和阴性对照中最高，而PUT3的蛋白表达低于PUT1和PUT2，并且没有与BL21（DE3）相比显着增加。根据该结果，将表达载体的拷贝数增加到一定范围有利于靶蛋白的表达，但靶蛋白的表达水平与拷贝数没有正相关。相反，高拷贝数会降低蛋白质表达。推测这种行为的一个可能原因是，当使用高拷贝质粒作为表达载体时，更多的能量和材料用于质粒的复制，这限制了靶蛋白的表达，并降低了合成能力。因此，PUT3产生的丁二胺滴度最低。体外酶催化实验进一步证实了上述结果。从相同生物量的PUT1，PUT2，PUT3和BL21（DE3）获得的粗酶溶液用于体外催化精氨酸，丁二胺的滴度如图5B所示，来自PUT2的粗酶溶液的转化效率最高。基于上述结果，选择中拷贝质粒pJN2作为最佳表达质粒，重组菌株PUT2用于其余研究中的发酵优化实验。

图5：不同拷贝数表达载体对靶蛋白（A）表达和体外酶催化丁二胺产生的影响（B）。泳道M：标记蛋白，泳道1:BL21（DE3），泳道2:PUT1，泳道3:PUT2，泳道4:PUT3。

3.4. 摇瓶和补料分批发酵

首先，基于SOB培养优化碳源添加类型。研究了葡萄糖（4g·L-1），甘露糖（4g·L-1），果糖（4g·L-1），蔗糖（3.8g·L-

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[257315]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章