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非靶向血浆代谢组学分析精液异常男性不育症
摘要
精液异常(SA)男性不育症已经成为世界性生殖健康问题。侵入性检查(例如睾丸活检)和人工密集型的精液采集法严重影响影响了男性不育的诊断。此外,男性不育的发病机理和生物学解释尚不清楚。本文采用GC-MC对84例精液异常(SA)患者,包括畸精症(TE)21例,弱精子症(AS)23例,少精子症(OL)20例,无精子症(AZ)20例和年龄相同的健康对照组(HC)29例进行判别分析,寻找潜在的生物标志物。采用多元统计法(偏最小二乘判别分析,PLS-DA)和单变量统计法(方差分析,ANOVA)比较TE与HC、AS与HC、OL与HC、AZ与HC的差异,得到了23个生物标志物。基于这些生物标志物,最相关的途径主要与碳水化合物、氨基酸和脂质的代谢有关。SA男性不育中的主要代谢改变包括能量相关代谢水平的升高,例如三羧酸循环,丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和饱和脂肪酸代谢等。此外,谷胱甘肽代谢水平的升高与氧化应激有关。最后,观察到精氨酸、脯氨酸代谢和磷酸肌醇代谢水平的降低。综上所述,血浆代谢组学是描述SA男性不育患者代谢紊乱的有效方法。从代谢途径分析,能量产生、氧化应激和精子发生过程中释放的酶是SA男性不育的主要原因。
1.引言
不孕不育是一个世界性的生殖健康问题,大约影响了15%的夫妇。男性不育占不育问题的60%。性功能正常并妊娠失败(即精液异常,SA)是男性不育的常见原因。根据精子密度、活力和精子形态,SA男性不育可分为畸精症(TE)、弱精子症(AS)、少精子症(OL)和无精子症(AZ)等不同亚组。如今,男性不育的诊断往往依赖于精液质量的检测结果,或者需要更多的侵入性手术干预。此外,SA男性不育的分子机制和生物学解释尚不清楚。因此,开发一种非侵入性的方法来诊断和阐明SA男性不育症的代谢途径和发病机制是十分迫切的。
代谢组学被认为是一种强大的系统生物学方法,致力于分析代谢的全局和动态变化。代谢组学分析可以通过分析体液(如血浆)和组织(如睾丸组织)来检测全面的内源性代谢物,包括有机酸、氨基酸、脂肪酸、糖、胆固醇和其他物质。结合先进的分析技术(如GC-MS、LC-MS和NMR)和高通量生物信息学工具,非靶向代谢组学方法正被广泛用于男性不育的分析。
虽然对男性不育的研究在不同的研究体系中都取得了很大的进展,但精液分析(精子密度、精子活力和精子形态)是目前男性不育应用最广泛的诊断方法。虽然男科诊所会尽力地安抚正在接受生育评估的男性,并且绝大多数男性都能提供精液样本,但收集精液样本对患者来说是一种尴尬、困难和有压力的体验。对于无精子症或隐精症的诊断,或出于治疗目的,也会采用一些侵入性手术,例如睾丸活检和显微解剖。这些侵入性手术可能导致炎症改变、血肿、实质纤维化或永久性的睾丸断流。相反,由于尿液、血清和血浆很容易获得,它们可能是更好的潜在生物基质。一些研究已经成功地将尿液、血清和血浆应用于男性不育的诊断。张等人报道了一种尿液代谢组学方法来诊断少精子症不育。通过血清代谢组学研究,探究了三组不同精子浓度(低、中、高)精子代谢组学分析的显著性差异。最近,我们课题组全面地提出了血浆代谢组学方法来区分能生育者和勃起功能障碍和SA患者。这些研究表明,尿液、血清和血浆适用于男性不育的分析。
男性不育的分子机制在其病因和治疗中起着重要作用。一些研究对男性不育的原因提供了一些解释,发现精索静脉曲张和氧化应激(OS)与男性不育有关。研究表明,通过精液分析,精索静脉曲张的存在似乎对精子密度、活性和形态有负面影响。对精浆中OS代谢组学分析的研究表明,OS对男性不育有很大影响。进一步的研究表明,OS会导致与男性不育有关的精子DNA损伤。然而,精索静脉曲张和OS的分子机制尚不清楚。最近,报道了一份对勃起功能障碍和精液异常的血浆代谢组学分析,并鉴定了一些生物标志物。然而,没有进一步的代谢通路分析(MPA)被用于识别的生物标志物。此外,尿液代谢组学对正常精子症不育男性进行了系统的代谢通路分析。通过MPA,解释了少精子症精子发生过程中能量产生、抗氧化和激素调节的途径。从本研究来看,代谢通路分析可以为男性不育的分子机制提供更多的解释。到目前为止,还没有全面的代谢组学研究同时报道对TE、AS、OL和AZ的完整MPA。
本研究建立了一种基于GC-MS、PLS-DA和MPA的血浆代谢组学方法,用于研究SA男性不育患者的代谢特征。本研究的目的是探讨血浆代谢组学能否用于区分健康对照(HC)和TE、AS、OL、AZ。然后,我们进一步研究了潜在的生物标志物和代谢通路来阐明SA男性不育的发病机制。
2.材料和方法
2.1试剂
高效液相色谱(HPLC)级甲醇购自Tedia公司(Inc.,Fairfield,USA),BSTFA 1%TMCS(N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺和1%三甲基氯硅烷用于GC)(gt;99.0%纯度)、盐酸甲氧胺(gt;98.0%纯度)和吡啶(gt;99.8%纯度)、内标2-异丙基苹果酸(gt;98.0%纯度)和其他25个代谢物化学标准品(S1表)均购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯市)。
2.2样本收集
所有受试者均为2015年6月至2015年12月在中南大学湘雅医院连续招募的志愿者。所有参与者都签署了书面知情同意书,每个参与者也被告知了这项研究的目的。本研究由湘雅医院医学伦理委员会批准。这项临床研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。这些不育男性是从因受孕失败至少12个月而去湘雅医院就诊的男性中收集的。采用问卷调查法收集年龄、吸烟史、饮酒史、代谢性疾病、遗传病、病史、性与生殖状况等信息。为了排除导致男性不育的综合因素的影响,在对男性不育的常规检查中如果发现以下任何情况,受试者将被从研究中排除:1) 目前有吸毒或酗酒史;2)代谢性疾病(糖尿病、冠心病、高脂血症)和泌尿生殖系统疾病;3)激素治疗和不育危险因素的病史(精索静脉曲张、输精管结扎和睾丸固定术);4)其他与男性不育有关的已知原因(遗传病、感染、职业暴露于药物)。在同一时期,其配偶在一年内生育过孩子或怀孕的有生育能力的男性被招募并抽样作为健康对照。
参考世界卫生组织(WHO)第五版《人类精液检查与处理实验室手册》,TE的定义为精子形态(正常形态)lt;4%;AS的定义为前向运动率lt;32%;OL的定义为每次射精精子总数lt;3900万;AZ的定义为精子总数=0。最终,113名受试者被分为五组。4个SA亚组包括TE(n=21,年龄:28.98plusmn;4.80),AS(n=23,年龄:28.85plusmn;5.38),OL(n=20,年龄:28.78plusmn;5.62),AZ(n=20,年龄:28.60plusmn;4.93)。29名可育男性(年龄:28.07plusmn;4.51)为HC。表S2对SA亚组和HC组的年龄、吸烟和饮酒进行了统计分析,在年龄、吸烟和饮酒方面没有观察到显著差异。禁食过夜后收集所有参与者的血样。每个人抽取静脉血样本,将血液收集到肝素化试管中,在4000times;g和4℃下离心20分钟。分离血浆,在分析前冷冻至-80˚C。
2.3样本制备
每100mu;L血浆样品加入300mu;L甲醇混合沉淀蛋白,然后加入30mu;L的内标(2-异丙基苹果酸/甲醇,1mg/mL)混合。然后,将混合物旋流混合15s,离心10min(16,000rpm,4˚C)。取上清液(330mu;L)移入5mL玻璃离心管中,用氮气蒸发干燥。然后向干燥试管中加入50mu;L甲氧胺/吡啶(20mg/mL),将得到的混合物涡旋混合30s,并在70˚C下用玻璃塞孵育1h。最后,将100mu;LBSTFA衍生剂加入到残留物中,涡旋混合30 s,然后用玻璃塞在70˚C的水浴中加热1h,取最终溶液进行GC-MS分析。,重点是,为了避免操作顺序的影响,所有样品经过处理后,都按随机顺序进行GC-MS分析。将每份血浆样品中的35mu;L等量混合,旋涡混合5min,制成质量控制(QC)样品。QC样品的样品制备按上述样品制备相同的方式进行。
2.4代谢组学分析
血浆代谢组学分析在岛津GC2010气相色谱仪上与岛津QP2010质谱仪(日本岛津)联用进行,并配有GL221-34618自动取样器。所有分析使用的色谱柱为Agilent DB-5MS,带有一个去活化的熔融硅胶柱(30mtimes;0.25mmtimes;0.25mu;m)。柱温程序设计如下:最初在70˚C保持4分钟,编程至300˚C,速率为8˚C/分钟,然后在300˚C保持3分钟。载气为氦气,流速为1.0mL/min。整个过程中,以3ml/min的流量开启隔膜冲洗。注入器温度、界面温度和离子源温度分别设置为280˚C、250˚C和200˚C。质谱仪在m/z 35~800的全扫描模式的电子轰击下工作,扫描速度为0.2s,检测器电压为0.96kV。通过70 eV电子束实现电离。
为了确保代谢组学分析的数据质量,在分析样品序列之前,对11个QC样品进行检验。每批进样顺序为1个QC-6个受试者样品-1个空白-1个QC-6个受试者样品-1个空白-1个QC。因此,每批由12个受试者样品,3个QC样品和2个空白样品组成,利用QC样品进行技术精度计算和信号校正。
2.5数据处理与分析
将原始数据文件(.D格式)转换为可以导入MS辅助信号分辨率(MARS)软件的NetCDF格式,利用基于多元分解方法的MARS软件,得到定性和定量的表格。所有检测到的峰特征都通过标准和NIST质谱搜索程序(2.0版)鉴定。
使用SPSS 24版本for Windows软件中的Dunnett后处理分析(p值lt;0.05)和方差分析(ANOVA)计算统计学意义。将所有代谢物的峰面积表导入SIMCA-P程序(版本14.1,Umetrics)进行多变量分析。主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)采用单位方差(UV)尺度。计算模型的R2X、R2Y、Q2Y、浓度-时间曲线下面积(AUC)和排列检验等参数,以评价多变量模型的质量,避免过度拟合的风险。采用MEV软件 (4.9版)进行分级聚类分析(HCA)。此外,使用代谢途径分析网络工具,包括MetPA (http://metpa.metabolomics.ca)和京都基因和基因组百科全书(KEGG, http://www.genome.jp/kegg/)识别潜在紊乱的代谢途径。SA男性不育症的代谢分析工作流程如图1所示。
3结果
3.1血浆样本的代谢分析
在本研究中,对所有的血浆样本进行了GC-MS分析。补充材料(图S1)中展示了TE,AS,OL,AZ和HC的血浆代谢谱图的典型离子色谱图(TIC)。如图S1所示,5组之间代谢物种类相似,但代谢物含量不同。保留时间、纯色谱图、质谱和峰面积等特征均由MARS软件提供。如表S1所示,NIST检索鉴定出53种代谢物,包括氨基酸、碳水化合物、脂质、有机酸和尿素。用R匹配法表示提取的质谱与NIST库中光谱之间的相似度。此外,有25种代谢物被明确地鉴别出来,并按照授权的化学标准进行了验证。在统计分析前,将每个样品中相应代谢物的所有峰面积归一化为内标物的峰面积。全程采用质量控制原则来确保数据的可靠性。根据美国食品药品监督管理局的规定,对于生物标志物发现的RSD(相对标准偏差)最高允许值为30%。我们计算了QC样品的相对标准偏差。从表S1得知,只有3个样本超过30%,去除这3个重复性较低的代谢物后,生成一个二维矩阵(113个样本times;50个变量)并将其导出进行统计分析。
3.2统计分析
主成分分析(PCA)是一种典型的无人模式识别技术,可以将113个样本times;50个变量的矩阵数据投影到低维空间。从PCA模型(R2X=0.879)的积分图(图S2)看,SA和HC的4个亚组完全重叠。
但是,汇集的QC样品清晰可见,表明样品分析序列具有令人满意的稳定性和重复性。对于每种代谢物,用方差分析和Dunnett后处理分析4个SA亚组和HC之间的p值(表S3),P值小于0.05表示差异显著。PLS-DA用于TE、AS、OL、AZ和HC的监督分类。PLS-DA模型的参数如下:TE-HC(R2X=0.407,R2Y=0.764,Q2=0.361,AUC=0.995),AS-HC(R2X=0.418,R2Y=0.901,Q2=0.437,AUC=0.998),OL-HC(R2X=0.518,R2Y=0.911,Q2=0.704,AUC=0.999),AZ-HC(R2X=0.487,R2Y=0.792,Q2=0.6,AUC=0.998)。在这些参数中,有4个PLS-DA模型很好地解释了原始矩阵。四个SA亚组在评分图中与HC明显分离(图2A, 2B, 2C和2D)。从图2E、图2F、图2G和图2H可以看出,排列检验计算的R2和Q2值比原来的值低,在垂直轴上的Q2截距小于零。因此,该模型是有效的。较高的AUC值(gt;0.99)表明该模型具有良好的预测性。在PLS-DA模型中,用投影中的变量重要性(VIP)值来评价代谢物的重要性。结果如表S4所示。
3.3候选生物标志物的发现
生物标志物的发现是代谢组学研究的关键步骤。信息代谢物的选择对于代谢途径分析和生物学解释具有重要意义。PLS-DA模型的VIP值间接反映了代谢物与疾病的相关性。表1列出了VIP大于1.00、方差分析p值小于0.05的4个生物标志物组合。4个生物标志物组合共包括34种代谢物,包括17种不同的代谢物。这17种生物标
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