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最适条件下醇链长度对己二酸酯酶法合成的影响
NAZ CHAIBAKHSH1,MOHD BASYARUDDIN ABDUL RAHMAN1,2,MAHIRAN BASRI1,ABU BAKAR SALLEH3,amp;RAJA NOOR ZALIHA RAJA ABDUL RAHMAN3
Department of Chemistry,Faculty of Science,University Putra Malaysia,Serdang,Malaysia,Structural Biology Research Center,Malaysia Genome Institute,Bangi,Malaysia and Institute of Bioscience,University Putra Malaysia,Serdang,Malaysia
(Received 22 November 2008;revised 29 April 2009;accepted 19 May 2009)
摘要
固定化的南极假丝酵母脂肪酶B(Novozym 435)已经应用在脂肪酸和不同碳链长度的醇(C1-C18)的酯化反应中。通过响应面法(RSM),对反应时间、温度、底物摩尔比、酶量等因素进行优化,从而得到了合成己二酸酯的最佳工艺条件。同时确定了该酶在己二酸酯合成过程中醇链长度的特异性。在以丁醇为原料时,可以在最短的反应时间(215min)内获得最大的酯产率。甲醇体系需要更多的反应时间(358min)和酶量(10.2%,w/w)来达到最大产率。合成己二酸二十八酯的最优温度和时间分别为65℃和523 min。结果表明,醇链长度是脂肪酶催化合成己二酸酯工艺优化的重要参数。在最适的反应条件下,酯化率高于97%。最佳条件可用于扩大该工艺的规模。
关键词:酯化、脂肪酶、己二酸酯、特异性、优化、响应面法
背景介绍
己二酸酯具有低毒性、良好的热稳定性、低挥发性和高生物降解性等优异性能,这使其在工业应用中具有重要意义,特别是在增塑剂、润滑剂、粘合剂、脱漆剂和涂料的制造中(Abdul Rahman等,2008)。由于己二酸和一元醇的成本相对较低,性能平衡良好,己二酸酯被广泛地合成(Gryglelewicz ,2001)。
酯化反应可由化学催化剂或酶催化。与传统的化学合成方法相比,利用酶作为生物催化剂来生产这些高附加值的酯类化合物具有反应条件温和、选择性和特异性高、能量要求低、产品分离和酶重复使用方便等显著优势(Petersson等,2005)。脂肪酶 (三酰甘油脂肪酶EC 3.1.1.3)是最通用的生物催化剂,被广泛用于直接合成多种酯(Athawale 等,2002;Gunawan等,2005;Park等,2006年)。在这些脂肪酶中,南极假丝酵母脂肪酶B被报道出对二羧酸如己二酸的酯化反应具有很高的催化活性(Abdul Rahman 等, 2008; McCabe amp; Taylor 2004)。
所有的酶反应都受实验条件影响。考虑到己二酸酯的高收益和需求,工艺优化在这些酯的经济合成中起着非常重要的作用。此外,对于未来大规模合成己二酸酯的任何设计,寻找最佳的反应条件是必不可少的。优化提供了找到理想条件的能力,因此对提高生产过程的效率有重大影响。在本研究中,响应面法(RSM)被应用于脂肪催化合成己二酸酯的优化。RSM是一种有效的统计技术,已成功地用于优化各种酯的酶合成(Macedo等.2004年;Gunawan等.2005年;Keng等.2005)。
对于一个有效的酶催化过程,还需要了解底物的特异性,包括底物的链长(Vaysse等. 2002)。酶催化机制包括结合和催化反应两个过程。因此,任何影响底物结合或催化生成产物速率的因素都会改变酶的底物特异性(Garcia-Allesamp;Gotor,1998年)。一种酶对不同底物的特异性很难预测,因为它受到许多因素的影响。虽然不同脂肪酶的底物链长度特异性已经在许多研究中进行了研究(Otto等, 2000年;Zaidi等,2002年;Ghamgui等,2004年。),影响酯化率的所有参数的最优值还尚未被用来确定酶的特异性。
在本工作中,获得了合成几种己二酸酯的最佳条件。本研究的主要目的是研究醇链长度对合成脂肪酸盐的最佳条件的影响(Scheme 1)。还测定了固定化南极假丝酵母脂肪酶B在脂肪酸酯合成中的醇特异性。
Scheme 1. Esterifification of adipic acid with alcohols of different chain length.
材料和方法
材料
Novozym435,南极假丝酵母脂肪酶B,固定在大孔丙烯酸树脂上(10000月桂酸丙酯units/g),购自NOVO Nordisk A/S(Bagsvaerd, Denmark)。己二酸和十八碳醇购自Merck Co. (Darmstadt, Germany)。甲醇、丁醇、辛醇和十二醇购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。本研究中使用的其他所有化学品和溶剂均属分析纯级。
脂肪酶催化酯化反应
根据RSM产生的不同底物摩尔比,将相应摩尔比例的己二酸和酒精混合在小瓶中。加入正己烷(5mL)作为溶剂。正己烷(log P=3.5)作为溶剂的选择是基于先前的研究,其中包括正己烷、庚烷、乙酸乙酯、丁醇和乙腈在内的几种溶剂,通过脂肪酶催化己二酸和不同醇的酯化反应筛选出活性最高的溶剂(Zaidan,2007年)。随后加入由RSM决定的不同量的脂肪酶。该反应是在150转/分的水平水浴摇床上进行的,由RSM确定不同的反应温度和反应时间。
分析和表征
用5m L乙醇-丙酮稀释物(50:50,v/v)终止反应,过滤去除脂肪酶。利用自动滴定仪(808 Titrando System; Metrohm, Herisau, Switzerland),用0.1M NaOH溶液滴定测定反应混合物中剩余的游离酸,直到pH=10的终点,但己二酸十八烷基酯除外。对于己二酸十八烷基酯,在热水浴中和酚酞指示剂存在条件下,用0.1M NaOH进行滴定分析。从空白(无酶)组和试验样品的值中计算出酸反应的摩尔量。形成的酯量相当于酸的转化量。同时,对产品进行TLC监测,使用氯仿-正己烷溶剂体系(95:5,v/v);以及气相色谱-质谱联合分析法监测,使用Shimadzu仪器(model GC 17A, model MS QP5050A; Shimadzu Corp., Tokyo, Japan),柱采用BPX5柱(0.25 mmtimes;_x0005_30 m, 25 mu;m),但己二酸十八烷基酯除外。 对于己二酸十八烷基酯,采用FT-IR光谱对其进行表征,测量其在在1734cm-1处的C=O吸收波段和1062,1169和1263处的C-O吸收波段,这是酯的拉伸振动特征波段。
实验设计,统计分析和优化
将RSM应用于脂肪酶催化合成己二酸酯的模型。为了获得合适的优化模型,采用了四因素五级中心复合设计(CCD),需要21个实验。分数阶乘设计由八个阶乘点、八个轴向点和五个中心点组成。变量包括时间、温度、酶量、底物摩尔比(醇:酸),它们的水平都是基于我们初步研究的结果。实验按随机顺序进行,并在每个实验中进行三次酯化产率的测量。
本研究使用软件Design Expert版本7.1.1(State-Ease Inc., Statistics Made Easy, Minneapolis, MN, USA),建立了一个二阶多项式方程,研究了变量对酯化收率的影响:
(1)
其中y是要建模的相关变量(百分比收益率);xi和xj是独立变量(因子);b0、bi、bii和bij是模型的回归系数;e是误差。通过测定系数(R2)和方差分析(ANOVA)对模型的拟合进行了评估。在可能的情况下,通过消除统计上无关紧要的项来简化模型。
利用Design Expert软件的优化功能,预测脂肪酶催化合成己二酸酯的最佳条件。对反应面方程进行了优化,将响应目标产率设置为100%,使用最小的酶量来产生最大的酯产率。 其他变量设置在合适范围内。
结果和讨论
将数据拟合到各种模型及其随后的方差分析表明,脂肪酸酯的合成最适合用二次多项式模型来描述。二次多项式模型(以编码因子为单位)如下。
己二酸二甲酯:
产率(%)= 92.76 2.99A 2.69B
12.03C 20.10D-10.93A2-3.39B2-6.49C2-9.65D2 8.48AB 6.82AC 5.90AD 14.28BD 4.85CD (2)
己二酸二丁酯:
产率(%)= 93.94 3.63A 6.47B
1.95C 10.39D-0.29A2-2.67B2-5.70D2 1.44AB-1.01AD 3.79BD-1.96CD (3)
己二酸二辛酯:
产率(%)= 92.20 10.58A 9.98B
10.61C 7.79D-3.67A2-5.48B2-15.91C2-1.63D2-2.56AC-3.83BC 2.32BD 2.40CD (4)
己二酸二癸酯:
产率(%)= 74.06 11.92A 5.26B
4.84C 11.79D 0.79A2-2.98B2-2.78C2-2.40D2 6.18AB 4.54AD-2.50BC-0.94CD (5)
己二酸十八烷基酯:
产率(%)= 71.32 9.63A 12.61B
5.30C 9.43D 2.63A2-5.10B2 0.084C2-0.55D2-1.54AB-3.05AC 1.03BC -0.27CD (6)
在方程(2)至(6)中,A是温度,B是时间,C是酶的量,D是底物摩尔比。
Table I. ANOVA results.
Source |
Sum of squares |
Degrees of freedom |
Mean square |
F-value |
P-value |
Dimethyl adipate Model |
10538.05 |
13 |
810.62 |
22.79 |
0.0002 |
Lack of fit |
205.82 |
3 |
68.61 |
6.35 |
0.0531 |
Dibutyl adipate Model |
3102.64 |
11 |
282.06 |
35.76 |
lt;0.0001 |
Lack of fit |
4.19 |
5 |
0.84 |
0.050 |
0.9972 |
Dioctyl adipate Model |
9283.27 |
12 |
773.61 |
116.58 |
lt;0.0001 |
Lack of fit |
45.53 |
4 |
11.38 |
6.02 |
0.0551 |
Didodecyl adipate Model |
5910.63 |
12 |
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