测量水果中VC含量的 UV-HPLC方法和还原剂的比较评估外文翻译资料

 2022-08-09 09:32:56

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测量水果中VC含量的

UV-HPLC方法和还原剂的比较评估

Isabel Odriozola-Serrano, Teresa Hernaacute;ndez-Jover, Olga Martıacute;n-Belloso

Department of Food Technology, UTPV-CeRTA, University of Lleida, Rovira Roure 191,

25198 Lleida, Spain

[摘要] 维生素C是水果蔬菜提供的最重要的抗氧化成分之一，因此需要一种简单可信的方法进行维生素C含量测定。本文通过草莓、西红柿和苹果中的抗坏血酸含量测定验证和比较两种UV-HPLC方法。此外，两种不同的还原剂[DL-1,4-二硫苏糖醇（DTT）或2,3-二巯基-1-丙醇（BAL）]用于区分脱氢抗坏血酸并测定维生素C。每种水果的UV-HPLC方法的可靠性均满足要求。UV-HPLC方法线性最高可达5mg/100g，最低检测限和定量限分别为＜0.18mg/100g和＜0.61mg/100g。作为相对标准偏差的精密度范围为0.6%~3.9%，回收率为93.6%~104.4%。尽管UV-HPLC方法可用于常规分析水果中的维生素C，当使用C18色谱柱和DTT还原剂的时候可达到最佳可靠性。并且这种选择的UV-HPLC方法可能是最简单便宜的。

[关键词] 抗坏血酸;维生素C;水果;可靠性;验证;比对

  1. 简介

术语维生素C被用作所有表现出抗坏血酸生物活性的化合物酸。它包括抗坏血酸的酯，合成形式如6-脱氧-L-抗坏血酸和氧化的化合物。但是，水果中的维生素C是假定为抗坏血酸（AA）加脱氢抗坏血酸（DHAA）的含量总和。这两种物质很容易被氧化，尤其是当暴露于高温下，一些二价阳离子（例如铜和铁），氧气，碱性pH，光或降解酶。而氧化DHAA的AA是可逆的，DHAA会发生不可逆的水解为二酮古洛糖酸，后者没有作为维生素C的生物活性。维生素氧化加工和烹饪过程中的损失非常令人担忧适用于营养学家，加工商和消费者。维生素C是用作健康相关水果质量的指标，因此与其他有益化合物相比，其对处理和存储过程中的降解更敏感。

由于维生素C的不稳定特性，应设计制备方法以避免维生素的损失。偏磷酸是最常用的溶剂，用来抑制L-抗坏血酸氧化酶和金属催化，此外还可沉淀蛋白质。另一方面，为测定维生素C含量，样品中的DHAA应还原为AA。通常，可通过维生素C含量差异（DHAA还原后）和抗坏血酸浓度（DHAA还原前）计算得样品中的DHAA含量。各种含硫醇的化合物，例如二硫苏糖醇（DTT）和二巯基丙醇（BAL）可用作还原剂。但是Diop, P. A.等人发现DHAA不完全还原为AA取决于还原剂的选择。

目前已有多种用于食品中维生素C含量分析的方法，包括电化学法、分光光度法、荧光光谱法和色谱法。但是高效液相色谱法（HPLC）具有专属性高、灵敏度高、操作简便等优势。反相色谱柱、氨基键合正向色谱柱、离子交换色谱柱或反向离子对色谱柱是最常规的用于维生素C分析的色谱柱。经检测得，紫外线在245nm和254nm之间的波长易于检测到AA。紫外线检测器通常包含在HPLC系统中，并且比其他方法更快更简单，但几乎没有UV-HPLC方法已被证实可用于食品中维生素C的测定。这些方法大多数已经过验证在啤酒，葡萄酒和水果饮料中。但是，水果不同于那些发酵产品，并且含有比饮料更复杂的基质，因此天然存在的化合物可能会影响AA的检测或干扰AA的鉴定和定量。Davey等人报告提到在研究用于分析其他不同基质的特定植物组织的方法时应格外注意。另一方面，可用文献表明，维生素C含量在不同水果和品种之间差异很大，范围在黑加仑的维生素C含量200~210mg/100g，至苹果的维生素C含量2-0mg/100g。

通常，水果往往是维生素C的良好来源。但是，梨、李子和苹果等水果仅含有非常少量的这种维生素。 因此，需要一种适当的方法来测量特定水果中维生素C的浓度。

本文旨在评估使用不同的UV-HPLC方法测定不同维生素C含量水果中维生素C的可行性。本实验选择草莓（维生素C高含量），番茄（中等含量）和苹果（低含量），运用两种还原剂和两种UV-HPLC方法。此外，在还原之前和之后测定AA，以计算样品中的DHAA。本实验对方法的可靠性进行评估，包括线性，灵敏度，精密度和回收率，并且在还原剂和UV-HPLC方法之间进行比较研究。

  1. 材料和方法
    1. 试剂种类

偏磷酸、DL-1,4-二硫苏糖醇（DTT）和2,3-二巯基-1-丙醇（BAL）购自Acros Organics (NJ, USA）；抗坏血酸、乙腈、磷酸二氢钾和硫酸购自Scharlau Chemie, SA (Barcelona, Spain)。

    1. 样品制备
      1. 样品溶液

从当地超市购买草莓、西红柿、苹果，并在实验前存放在4(plusmn;1)℃条件下。运用Brubacher等提供的方法对样品进行提取。将25g水果加入25ml 4.5%的偏磷酸溶液中混匀，将混合物以22100g在4℃下离心15分钟。通过Whatman No. 1真空过滤上清液。然后用Millipore 0.45mu;m滤膜过滤10ml即得可用于注入HPLC系统的样品溶液。

      1. 维生素C标准品溶液

本实验采用两种不同的还原剂以测量维生素C的总浓度。按照Saacute;nchez-Mata等人提出的方法，制备DTT溶液（20mg/mL）并取等分的0.2ml加入1ml经过AA分析的真空过滤样品中。根据Soliva-Fortuny等人提出的方法，将等分的2mu;l其他还原剂（BAL）与每毫升真空过滤的样品混合。 将混合物在黑暗中放置2小时。 然后将它们通过Millipore 0.45mu;m滤膜并注入HPLC系统。

DHAA含量通过维生素C（还原后）和AA（未还原）进行计算。

    1. 液相色谱条件

HPLC系统配备有600控制器和486吸光度检测器（Waters，Milford，MA），工作波长为245 nm。通过配备有样品定量环（20mu;l）的手动进样器将样品注入色谱柱。室温下流速固定为1.0ml/min。运用两种不同的色谱条件：（a）将反相C18 Spherisorbreg; ODS2 （5mu;m）不锈钢柱（4.6 mm 250 mm）用作固定相。 流动相为0.01％的硫酸溶液，调节至pH 2.6。 （b）使用NH2-Spherisorb S5色谱柱（250times;4.6mm，5mu;m）。 洗脱液为10 mM磷酸二氢钾缓冲液，调节至pH 3.5，并在等梯度条件下以60:40的比例混合乙腈。

    1. 方法学验证

通过线性、灵敏度、精密度和回收率实验验证HPLC方法可靠性。

      1. 线性

验证结果满足正态分布，可通过酸抗坏血酸的浓度（自变量）与通过HPLC-UV检测器获得的吸光度（因变量）之间的关系来评估线性。然后进行回归方差分析得出残差图。将实验费舍尔值（Ftab）与1和n－2自由度的列表值（Ftab）进行比较。测定系数（r2）通过最小二乘法分析来计算。对于每种色谱条件和还原剂，执行三个校准线。此外，每条校准线都是通过对每种浓度的抗坏血酸（0.5、1、1.5、3、5 mg/100g）进行三份重复测定而得出的可以由线性回归模型解释的响应的总可变性的程度。

      1. 灵敏度

使用定义为等式（1）和（2）的Long和Winefordner标准，由定义线性的校准线计算出检测限（DL）和定量限（QL）。其中a是校准线的斜率，S是截取点的标准误差。

      1. 精确度

该方法的精确度表明同一样品在一系列测定中的分散程度。对草莓，西红柿和苹果使用的每种UV-HPLC方法和还原剂均进行了六次测量，共144个样品。用标准偏差除以浓度平均值计算相对标准偏差（RSDexp），并评估（RSDexp）是否符合Horwitz标准。

      1. 回收率

通过标准添加程序在草莓，西红柿和苹果上的每种方法的两个水平上测试回收率。加入样品中的AA浓度为：草莓30和60 mg/100g，西红柿10和20 mg/100g，苹果1.5和3 mg/100g。 在每个添加水平中，每种UV-HPLC方法，还原剂和水果（216个样品）均进行了六次测定，并在每种情况下进行回收率（%）计算。 通过Cochran检验验证了添加水平之间方差的均一性。使用Studentrsquo;s t检验比较每个水平的平均回收率，将（n－1）的实验值（texp）与列表值（ttab）进行比较自由度。因此，当texp低于ttab时，可以考虑两个级别的平均值。

    1. 方法比对

运用比较程序发现，在添加或不添加还原剂的情况下，整个UV-HPLC方法获得的平均值之间存在显著差异。最低显著性差异检验用于确定平均值为5%的均值之间的差异。此外，使用Bland和Altman的原理比较UV-HPLC方法和还原剂的种类。使用Statgraphics Plus v.5.1 Windows软件包（Statistical Graphics Co.，Rockville，MD）进行统计处理。对三个校准线及其各自的r值的线性进行了比较研究，DL和QL的灵敏度，RSD值的精度。为对回收率进行比较测试，在每种情况下都要考虑每组分析的所有回收率值。

  1. 结果与讨论
    1. 方法学验证
      1. 线性

根据表1中所示的测定系数（r2），添加和不添加还原剂时，AA的吸光度响应呈线性线性变化，最高可达5 mg / 100 g。此外，残留物含量随机分布在零均值线周围（图1）。因此，无论是否添加还原剂，回归模型均能正确代表所有HPLC-UV方法的数据。两种UV-HPLC方法，将硫酸（0.01%）的流动相调节至pH 2.6的C18色谱柱，和将10 mM磷酸二氢钾缓冲液调节至pH 3.5与乙腈（60:40）作为流动相的NH2色谱柱，AA浓度与所获得的面积之间都存在良好的关系。在每种方法和所用还原剂中，测定系数（r2）均高于99.36％。另一方面，在未添加还原剂的情况下，在UV-HPLC方法之间观察到校准线的相似斜率。但是，使用NH2色谱柱时的斜率低于C18色谱柱。这些不同斜率的结果可能影响的方法的灵敏度。

表1 测定抗坏血酸的UV-HPLC方法的线性和灵敏度实验结果

Table 1 Linearity and sensitivity for the evaluated UV-HPLC methods to determine ascorbic acid

色谱柱

还原剂

回归线方程a

r2

标准差b

DLc (mg/100g)

QLc (mg/100g)

-C18

-

y = 651431x - 15425

99.44

36983

0.17

0.57

DTT

Y = 619745x 48537

99.36

37702

0.18

0.61

BAL

Y = 649402x – 414

99.60

31373

0.14

0.48

-NH2

-

Y = 616385x 44301 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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