活性污泥中分离出的JDC-2和JDC-32协同降解PAE外文翻译资料

 2022-08-10 17:00:56

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活性污泥中分离出的JDC-2和JDC-32协同降解PAE

摘要：以邻苯二甲酸酯（PAE）的混合物作为唯一碳源和能量来源，从活性污泥中分离出了两个细菌菌株。通过16SrRNA基因序列分析，所分离的菌株分别被鉴定为戈登氏菌菌株JDC-2和节杆菌属菌株JDC-32。戈登氏菌菌株JDC-2可将邻苯二甲酸二正辛酯（DOP）迅速降解为邻苯二甲酸（PA），并在培养基中积累。节杆菌菌株JDC-32可以降解PA，但无法降解DOP。戈登氏菌JDC-2菌株和节杆菌JDC-32菌株的共同培养突破了单种菌株的降解限制，达到完全降解DOP的效果。在降解中间体已确定的基础之上，提出了用戈登氏菌JDC-2菌株降解DOP的生化途径。研究结果表明，DOP是被活性污泥中所分离出的不同微生物的生化协同作用完全降解的。

关键词: 降解作用；邻苯二甲酸二辛酯；节杆菌属；戈登氏菌属；生化协同作用

1.简介

邻苯二甲酸酯（PAE）是一组化合物的统称，主要用作聚氯乙烯（PVC）塑料中的增塑剂。半个多世纪以来，它们一直被用来提高某些聚合材料的柔韧性。由于邻苯二甲酸酯与塑料生产原料的混合物之间并非化学键合，所以在产品的使用寿命期间它们很容易渗出[1]。因此，在全国各地的各种环境中都能够被检测到，例如沉积物、自然水体、土壤，甚至在大气中也有[2-5]。近年来，邻苯二甲酸盐由于疑似具有致癌，雌激素和破坏内分泌等特性[6]，已成为极大的环境隐患。包括邻苯二甲酸二甲酯（DMP），邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二正辛酯（DOP）在内的一些PAE已经被中国国家环境监测中心[7]和美国环境保护局列为优先污染物[8]。

DOP是邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯（DEHP）的直链异构体，DEHP是最常用的增塑剂之一，其烷基链中有八个碳原子。在过去的几十年中，已经有大量关于PAE生物降解性的研究报道[9]。被普遍公认的是，与具有较长酯链的邻苯二甲酸酯（例如邻苯二甲酸二辛酯（DOP）、邻苯二甲酸二-2-乙基己酯（DEHP））相比，具有较短酯链的邻苯二甲酸酯（例如邻苯二甲酸二甲酯（DMP），邻苯二甲酸二乙酯（DEP）和邻苯二甲酸二丁酯（DBP））更易于生物降解和矿化 [10-13]。尽管对DEHP在各种条件下的降解情况已经进行了许多研究[14-19]，但是关于DOP生物降解性的研究却很少[7,20-22]。而且研究发现DOP的降解速率相对较慢。因此，分离出可以完全降解DOP的细菌菌株具有重要意义。尽管某些微生物能够完全矿化邻苯二甲酸酯，但环境中混合的微生物种群似乎可以更有效地提高降解效率 [1]。迄今为止，相比于单一菌株的分部利用，已有许多关于混合培养物联合体完全矿化特定PAEs的报道[23-26]。但是以前关于DOP降解的研究大多数都把注意力集中在纯化物的初步降解上[20-22]。因此，尚未有关于由筛选后的微生物混合体完全降解DOP的研究发表。此外，生化途径降解DOP的表征目前无文献描述。

目前的研究描述了活性污泥中分离出这两种降解PAEs的细菌菌株及其特性。并且发现这两种菌株结合起来可完全降解DOP。此外，在确定了可能的降解中间体的基础上，本文提出了DOP的降解途径及每种微生物在降解中作的贡献。

2 材料和方法

2.1 化学制品

纯度为99％的DOP和邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）购自Aldrich-Sigma Chemicals（密苏里州圣路易斯）。邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二异辛酯（DIOP）均从中国医药集团获得。所有其他化学试剂均为分析等级，所有溶剂均为HPLC等级。

2.2 微生物来源

从两个样品（A和B）中分离出用于降解实验的细菌。样品A来自湖南省常德市定城区收集的河道污泥，而样品B是从江西省永新市曲江采集的污水污泥。实验前将污泥样品保存在塑料袋中，并在4℃下保存一周。

2.3 细菌富集和分离

在所有实验（包括富集实验）中使用的最小盐培养基（MSM）[27]包含（g / l）：K2HPO4 5.8 g，KH2PO4 4.5 g，(NH4)2SO4 2.0 g，MgCl2 0.16 g，CaCl2 0.02 g，Na2MoO4·2H2O 0.0024g，FeCl3 0.0018g，MnCl 2·2H2O 0.0015g。用HCl或NaOH将MSM的pH值调节到7.0，然后121℃高压灭菌20分钟。将18 g琼脂添加到1L MSM中以制备琼脂平板。富集过程类似于Chao等人所描述的[27]并在此基础上进行了一些修改。最初，将5.0 g污泥添加到含有200 ml MSM溶液的500 ml锥形烧瓶中，用PAEs（200 mg/l）的混合物（每50 mg/l）对DMP、DEP、DBP和DOP进行修正。在30℃下黑暗环境中，将悬浮液置于转速为175转/分的旋转振动筛上培养7天。随后，将2ml的富集培养物连续转移四次至新鲜培养基（每个均含有较高浓度的PAEs（240-500mg/l））中，并在相同条件下培养。然后用接种环将最后的浓缩液在MSM琼脂（18g/l）平板上划线，再添加PAEs混合物（500mg/l），并在30℃下培养1周。根据菌落形态和颜色的差异筛选出所需的菌落，并将其重新划线到用PAE混合物改良后的MSM琼脂平板上。细菌分离物可通过在LB营养琼脂平板上划线培养来进一步纯化，然后分别在含有和无PAE的条件下再分别划线到MSM琼脂平板上以确认其降解能力。筛选出在含有PAEs的培养基中显示生长，但在无PAEs下不显示生长的分离株进行下一步研究。

2.4细菌的鉴定和生物学特性

在光学显微镜下观察染色细胞的革兰氏反应和细胞形态。首先通过生理生化标准鉴定方法对细胞进行鉴定，再使用16S rRNA基因测序法对纯培养的菌株进行了进一步鉴定。为了提取用于16S rRNA基因扩增的菌株基因组DNA，吸取2ml经PAEs修饰的MSM液体培养液并离心。用磷酸盐缓冲液（PBS，0.05mol/l，pH7.4）洗涤细胞颗粒三次，然后在200 l Tris/EDTA（TE）缓冲液（pH8.0）中重新悬浮。根据制造商的说明，使用EZ-10旋转柱基因组DNA微量提取试剂盒（Bio Basic Inc.，加拿大万锦，加拿大安大略省）提取基因组DNA。然后用细菌通用引物F27和R1492扩增来自基因组DNA的16S rRNA基因。按照制造商的说明，使用E.Z.N.A.凝胶提取试剂盒（Omega Bio-Tek，Inc.，Doraville，GA）纯化PCR产物，然后对其进行测序（中国上海Sangon）。将细菌的16S rRNA基因序列进行比对并与DNA序列数据库中的细菌基因序列进行比较。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库检索最接近的并引用，并将其与CLUSTALW对齐，所有参数均设置为其默认值。然后通过邻居连接算法和MEGA4.1中实现的碱基取代的Kimura II参数模型生成系统发育树。使用引导程序分析重复1000次，对发育树进行验证。

2.5 基质利用率测试

对菌株JDC-2和JDC-32在各种碳源上的生长能力进行测试。分别以原儿茶酸（PCA）、邻苯二甲酸（PA）、DMP、DEP、DBP、DOP、DIOP和DINP（200 mg/l）作为碳源，对液态MSM进行补充，以检测PAEs降解菌株利用这些化合物的能力。将PA和PCA溶解在氯仿中，并通过0.22 m的膜过滤进行灭菌。将另一些直接加入MSM培养基中并高压灭菌。使用UV-9200分光光度计（Rayleigh Analytical Instrument Corp.，北京，中国）通过在600 nm（OD600）处的光密度测量和显微镜观察来确定培养瓶中的微生物生长情况。

2.6 降解实验

30℃下将添加有PAE的MSM置于旋转振荡器上，以150 rpm的速度运转36 h后收获细胞，在无菌条件下用0.05 mol / l磷酸钾缓冲液（pH 7.5）洗涤3次，使其重新悬浮在相同的磷酸盐缓冲液中至OD600为0.2。分别研究各菌株（1毫升悬浮液）和混合体（1毫升各菌株）在20毫升无菌MSM中降解DOP（500毫克/升）的情况，将这些MSM放在50毫升锥形烧瓶中，在30℃下在转速为150转/分的旋转振动筛上进行培养。使摇床在黑暗中以150 rpm的速度运转。每隔6小时将20 ml二氯甲烷直接添加到各个烧瓶中，然后剧烈振摇3分钟。将得到的重质乳液离心（5000 rpm，5分钟），并将水相萃取两次。将二氯甲烷相蒸发至干燥，溶解于10ml甲醇中以作进一步分析。同时研究在相同条件下，在200毫升灭菌后的MSM中的每株菌种（1毫升悬浮液），在500毫升的锥形烧瓶中对PA（500毫克/升）的降解情况。定期用无菌注射器取出含水样品（1 ml），并保存在-20℃下以进行光密度测量和进一步的HPLC分析。所有实验均重复三次。以类似的方式定期分析样品和进行无菌对照（未接种的MSM）。如前所述，通过测量光密度（OD600）来确定培养瓶中的微生物生物量。

2.7 HPLC分析残留底物

将冷冻的等分试样解冻，通过0.22m的膜滤器过滤，然后注入（20L）配备有UV230 紫外检测器和Hypersil BDS-C18（200m mtimes;4.6mm，5m）色谱柱的高效液相色谱系统（Elite系列；Elite，中国大连）。用于检测DOP的流动相为甲醇：水（90:10，v / v），流速为1 ml/min，紫外线波长为254 nm。用于分离PA的流动相为甲醇：1％乙酸水（40：60，v / v），流速为0.5 ml/min，紫外线波长为228 nm。校准曲线在12.5–500 mg / l范围内呈线性。

2.8 通过GC / MS分析DOP降解的衍生产物

为了检测降解过程中的次要中间产物，将上面提取的样品浓缩至1 ml，然后使用配有极化离子阱质谱仪（GC-MS，Thermo Electron Corporation，Austin，TX）的Thermofinigan痕量GC2000进行GC/MS分析。采用超纯氦为载体（流速1 ml min-1），在30m DB-5MS弹性石英毛细管柱（0.25 m膜厚，内径0.25 mm；温度保持在60°C 3分钟，从5°C 每分钟到280°C 每15分钟，然后迅速冷却到60°C）上进行气相色谱分析。对于以正电子电离（EI）模式收集的质谱图，源温度为250℃，电子电离能为70 eV，质量范围为40–500 mu，并以分离模式（1:10）注入1 l提取样品。通过与标准化合物的保留时间和质谱图进行比较，使用NIST质谱检索程序（美国国家标准技术研究院，盖瑟斯堡，马里兰）来鉴定信号。

3 结果

3.1 分离和生物学特性

在琼脂平板和液体培养基上获得了两种细菌分离株（JDC-2和JDC-32），它们可以利用琼脂平板和液体培养物中的PAE混合物作为唯一碳源和能量来源。 JDC-2菌株是戈登氏阳性棒状需氧菌，会在LB琼脂平板上形成圆形红色菌落。菌株JDC-32也是戈登氏阳性专性需氧菌，在LB琼脂平板上形成黄色光滑的圆形菌落，呈杆状球菌循环。表1总结了这两个分离株的某些表型特征。基于BLAST对其16S rRNA基因序列的分析，JDC-2属于Gordonia属（GenBank登录号FJ851356），而JDC-32似乎是节杆菌属（FJ851358）。图1说明了JDC-2和JDC-32与它们的近亲

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