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假蜜环菌（E-20）胞内黄曲霉毒素解毒酶的制备、纯化及性质研究

摘要：以前有报道称某些假蜜环菌（E-20）多酶对黄曲霉毒素具有解毒作用。在本文中，我们描述了一种称为黄曲霉毒素解毒酶的细胞内酶的分离纯化，该酶对黄曲霉毒素B₁（AFB₁）表现出解毒活性。这种黄曲霉毒素解毒酶在pH6.0和28℃下的比活性为7.09nmolmin/mg。通过SDS-PAGE测定，表观分子量为51.8kDa。等电点估计为5.4，在pH6.8和35℃时酶的活性最佳。纯化酶的活性通过埃姆斯测验确认。

关键词：解毒；黄曲霉毒素B₁；真菌酶

1介绍

黄曲霉毒素B₁（AFB₁）是谷物霉菌黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一种强力的肝致癌物，是人类食品中广泛的污染物。黄曲霉毒素解毒的化学和物理方法目前很发达（Adegoke等，1991；Mukendi等，1991；Samarajeewa等，1991Park等，1993），但通常会对食品产生负面影响（Maeba等人，1988；Mercado等人，1991；Nataranjan，1991；Scheideler，1993）相反，酶解毒与化学和物理解毒相比似乎具有一些优势，因为它对底物具有选择性。以前，我们曾报道过从假蜜环菌（Armillariella tabescens）获得的多酶系统（JSNMC，1977）表现出排毒活性（Liuetal.，1998）。目前的工作是为了报告该酶对AFB₁具有排毒活性。该酶被作者称为黄曲霉毒素解毒酶（ADTZ），因其安全解毒和在食品工业中的潜在应用而备受关注。本文报道了食用菌A. tabescens（E-20）对胞内ADTZ的纯化和表征。

2材料和方法

2.1ADTZ生产

2.2.1微生物

使用假蜜环菌株（E-20，从中国微生物研究院 获得）孢子作为实验菌。

2.1.2培养基

使用的培养基包含0.5％（w/v）的麦芽提取物，1％（w/v）的酵母提取物，0.1％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄和0.01％维生素B₁，0.01％（w/v）的CaCl₂。麦芽糖（5％，w/v），葡萄糖（5％，w/v），果糖（2％，w/v），乳糖（2％，w/v）或蔗糖（2％，w/v）为用作碳源。在灭菌之前，用0.1NKOH将培养基的pH调至6.0。

2.1.3接种物

通过向马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）的原种培养物中添加无菌水（10ml），来制备真菌的孢子悬浮液。然后将悬浮液加到折流底锥形瓶中的100ml培养基中。将后者在28℃的轨道培养箱中以180rpm的速度摇动7天。然后将等分试样（0.6ml）与无菌甘油（15％，v/v）混合并冷冻。通过干重测量，它们的生物质浓度估计为18.37g/l。然后通过将约25g菌丝体（通过无菌操作过滤获得）添加到折流底锥形瓶中的250ml培养基中来制备培养物。得到的初始生物量为100g/l。将烧瓶以200rpm的速度在27℃下摇动7天。

2.1.4培养

将培养基接种于折流底锥形瓶中（50ml），然后在轨道培养箱中以200rpm的速度在27℃下摇动7天。通过离心收获含有菌丝体沉淀物（15000g，在4oC下1小时）的培养物，并在4℃下用50mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）洗涤两次。

2.1.5匀浆制备

采用三种方法制备匀浆：

1. 超声处理：将10g真菌生物质重悬于60ml、pH为6.0、含有0.6MKCl的50mM磷酸盐缓冲液（缓冲液A）中，并在250瓦特下超声处理3次，每次5分钟。脉冲模式（振动电池装置，超音速和材料）。
2. 冷冻均质物：将10g真菌生物质放入研钵中，并用液氮研磨。将粉末悬浮在60ml、pH为6.0的50mM磷酸盐缓冲液中。
3. 原生质体：将10g真菌生物质与60ml、50mM、pH为7.5的磷酸盐缓冲液孵育，该缓冲液含有0.6MKCl（缓冲液B）和10mg/ml溶血酶（Sigma，美国）和10mg/ml纤维素酶（Sigma，美国）。将介质在20℃下以140rpm的速度振荡5小时。通过光学显微镜检查原生质体的形成。然后将原生质体离心（在4℃下3000g离心10分钟），重悬于60ml缓冲液A中，并用Potter-teflon匀浆器（Bioblock Scientific，法国）分解。

2.2酶纯化

2.2.1硫酸铵沉淀

快速冷冻和解冻循环后，将BaCl₂添加到生物质混合物中，浓度为2mM。将所得的匀浆在4℃下以25000g离心30分钟，以除去细胞碎片。用硫酸铵处理无细胞的上清液。将在80%饱和度下获得的部分重悬于含有1.0M硫酸铵的pH6.0的20mM磷酸盐缓冲液中，并在同一缓冲液中透析过夜。

2.2.2离子交换色谱

在DEAE-Sephadex12/15柱（Pharmacia）上进行离子交换色谱法（IEC）。用pH6.0的20 mM磷酸盐缓冲液和0.5 MNaCl的一步梯度在同一缓冲液中进行洗脱。以0.2ml/min的流速收集2ml的馏分。

2.2.3色谱聚焦

在用25mM咪唑-HCl缓冲液pH7.4平衡的Mono-p^TM PBE94 5/20色谱柱（Pharmacia）上进行色谱聚焦。注射样品（1ml），并用pH4.0的多缓冲溶液（Polybuffer^reg;74，Pharmacia）在25℃下以0.2m/min的流速洗脱蛋白质。收集洗脱液，每次0.5ml。然后将酶在去离子水中透析，然后冷冻干燥。

2.3酶表征

2.3.1电泳法

使用Pharmacia 快速凝胶电泳系统，用10-15％的梯度Phastgel（Pharmacia）实现天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。用考马斯亮蓝对蛋白质进行染色，并使用Pharmacia高分子量蛋白质试剂盒作为标准来估算分子量（Laemmli，1970；Neuhoff等，1988）。

2.3.2等电聚焦

通过在Phastgel IEF 3-9上进行等电聚焦（IEF）估算酶的等电点（pI）。使用Pharmacia pI校准试剂盒（pH范围3.0-10.0）作为标准蛋白质，并经过硝酸银染色（Kapitany和Zebrowski，1973）。

2.3.3高效薄层色谱（HPTLC）分析

将200ngAFB₁加入1ml0.05M磷酸盐缓冲液（pH6.0）和2mMBaCl₂和4mg蛋白/ml酶中，然后在30℃下孵育30分钟。根据官方分析化学家协会（Tosch等，1984），用氯仿提取处理后的样品。通过添加两倍体积的氯仿终止反应。将氯仿中的样品提取物在氮气流中干燥。干燥后的样品在苯-乙腈（98:2，v/v）溶剂体系中进行薄层色谱分析。将5-50ngAFB₁点样到高效硅胶层析板上（Merck，德国），并使用氯仿-丙酮（88:12，v/v）溶剂系统进行展开。用TLC扫描仪CS-9301（日本岛津）在365nm激发下用荧光光度法测定平板上的AFB₁。解毒酶单位定义：每单位ADTZ每分钟解毒（分解）1ngAFB₁。

2.3.4紫外线吸收光谱

将133.3ngAFB₁用1mL20mMTris-HCl缓冲液（pH6.6）溶解，该缓冲液含有2U/ml酶和2mMBaCl₂100micro;L。在30℃下温育30分钟后，向混合溶液中加入2ml甲醇以终止反应。通过使用紫外可见分光光度计（Shimadzu UV-260，日本）进行波长扫描。

2.3.5金属离子的影响

研究了用10种不同的金属离子（MgCl₂、FeCl₃、FeCl₂、CoSO₄、CuCl₂、NiCl₂、Cr₂(SO4)₃、MnCl₂、ZnCl₂、BaCl₂或15mM EDTA）分别取代2mMBaCl₂时金属离子对酶相对活性的影响。

2.3.6致突变性测试

对于Ames测试，初始AFB₁浓度为200ppb，ADTZ为10U/ml。使用鼠伤寒沙门氏菌TA98通过Ames试验确定纯化的ADTZ处理的AFB₁的致突变性。将处理过的AFB₁和对照样品的氯仿提取液等分试样在氮气下干燥，然后溶解并用DMSO（美国Sigma公司）连续稀释以进行致突变性测试（0.8micro;g/50micro;l和50micro;l/板），其由在大鼠肝S-9混合物存在下的板结合试验组成。用Aroclor-1254诱导大鼠制备S-9代谢活化系统。将0.1ml鼠伤寒沙门氏菌TA98隔夜培养物与测试样品以及0.5mlS-9混合物一起添加到2.5ml含有少量组氨酸和生物素的顶部琼脂中。将混合物放置在最小培养基琼脂板上，在37°C下培养48小时，并根据先前报告的方法对回复菌落进行计数（Ames等人，1975；Maron和Ames，1983）。以2-氨基芴为阳性对照。

3结果

3.1假蜜环菌（E-20）生产ADTZ

初步制备了含麦芽糖（5%，w/v）、葡萄糖（5%，w/v）、果糖（2%，w/v）、乳糖（2%，w/v）或蔗糖（2%，w/v）的5种不同培养基，并接种了假蜜环菌（E-20）。常规测定5种预培养物的糖含量和细胞生长，以确定最佳的预培养时间。采用3天（葡萄糖和乳糖）和4天（果糖、麦芽糖和蔗糖）生物量预培养。以葡萄糖或乳糖为碳源，进一步用预培养基接种两种液体培养基。培养结束时，肉汤由一个致密的菌丝体组成。为了优化ADTZ的生产，在7天内测量了以下指标：pH值、细胞生长、总糖含量和ADTZ活性。乳糖培养4天后和葡萄糖培养5天后达到最大ADTZ活性（图1a和b）。

Fig. 1. Growth of A. tabescens and aflatoxin-detoxifizyme (ADTZ) production: 10% of the culture inoculated to 100 ml medium in a baffled Erlenmeyer flask. Medium contained malt extract (0.5%, w/v), yeast extract (1%, w/v), K₂HPO₄, (0.1%) MgSO₄ (0.05%), vitamin B₁ (0.01%) and CaCl₂ (0.01%, w/v). Also, either glucose (5%, w/v) (a) or lactose (2%, w/v) (b) was used as the carbon source; cultured with shaking at 200 rpm at27℃ for 7 days. The activity was determined by using AFB₁ as the substrate. The biomass concentration was estimated by a dry weight measurement.

3.2ADTZ纯化

通过将固体硫酸铵添加到上清液中沉淀蛋白质。80％的饱和硫酸铵可获得最大的ADTZ回收率。通过阳离子交换色谱（图2a）和色谱聚焦（图2b）进一步纯化ADTZ。表1总结了纯化步骤的细节。

Fig. 2. (a) Ion exchange chromatography on DEAE-sephadex: proteins,▼relative activity,●and NaCl concentration (B%, 100%=20 mM phosphate 1 M NaCl),-. After equilibration of the column with 20 mM phosphate buffer pH 6.0, proteins were eluted with a gradient of sodium chloride at

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