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以硫转化为中心的EBPR工艺处理高温含盐废水中聚磷酸盐积累的研究
Hai-Guang Wang a, Hao Huang a, Ru-Long Liu b, Yan-Ping Mao c, Basanta Kumar Biswal a,
Guang-Hao Chen a, d, Di Wu a, d, *
a Department of Civil and Environmental Engineering, Chinese National Engineering Research Center for Control amp; Treatment of Heavy Metal Pollution
（Hong Kong Branch） and Water Technology Center, The Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong, China
b Department of Marine Science, Shanghai Ocean University, Shanghai, China
c College of Chemistry and Environmental Engineering, Shenzhen University, Shenzhen, Guangdong, China
d HKUST Shenzhen Research Institute, FYT Graduate School, The Hong Kong University of Science and Technology, Guangdong, China
摘要：这项研究考察了一项以硫转化为中心的新型强化生物除磷（SEBPR）工艺中聚磷酸盐的积累速率。SEBPR体系持续地在交替厌氧和缺氧模式的序批式反应器（SBR）中运行了120天（温度：30℃，盐度：6000mg/L Cl-）。除了SBR之外，还进行了分批试验，以测试两种不同硫酸盐浓度对系统性能和硫磷转化的影响。使用先进的显微镜发现了由聚磷酸盐和聚硫组成的关键胞内聚合物。应用宏基因组分析表征了SEBPR系统中富集微生物的多样性及其功能。最后，采用包括流式细胞仪细胞分选和16S DNA高通量测序的几项分子技术鉴定聚磷菌（PAO）。磷释放量和磷吸收量逐渐增加，分别达到至近18plusmn;6.4毫克磷/升和26.5plusmn;6.7毫克磷/升，净磷去除率为84.25%。分批试验表明没有聚羟基脂肪酸（PHA）的生成，但是观测到有摄磷过程，并且它与细胞内聚硫的消耗相关。这表明聚硫可以作为摄磷和形成聚磷酸盐的胞内能量来源。而且，CLSM和TEM的显微图各自清晰地显示了胞内聚磷酸盐和聚硫的存在。宏基因组分析表明，变形杆菌属（36.5%）、拟杆菌属（23.3%）、嗜热菌属（7.1%）、拟杆菌属（4.5%）和厚壁菌属（2.3%）是细菌的优势门。检测到传统聚磷菌嗜酸假丝酵母的丰度只有0.32%；推测在科的水平上接近于红细菌科的一个未培养属为推定的硫式磷酸菌（SPAO）。最终，这项研究显示聚硫很大程度上影响了SEBPR体系中无PHA生成时聚磷酸盐的积累。
关键字：含盐废水；以硫转化为中心的EBPR（SEBPR）工艺；聚磷酸盐；聚硫；聚磷菌（PAOs）；硫细菌
1.前言
磷（P）是敏感水体中富营养化和藻类暴发的控制因素。如果没有正确地处理，有害藻类的泛滥生长将会威胁到人类和环境的健康和安全。水体富营养化更多地伴随着温暖天气出现在海岸地区（Sparrow and Heimann, 2007；Heisler等人，2008）。为了去除含磷污染物，在上世纪80年代就开发了强化生物除磷（EBPR）工艺并将其投入应用（Mino等人，1985；Wentzel等人，1989；Smolder等人，1994）。这项生物处理工艺受聚磷菌（PAOs）的影响，且通常分为两步运行：首先，在厌氧条件下，胞内聚磷酸盐被降解成正磷酸盐（“释磷”），且挥发性脂肪酸（VFAs）被吸收转化为胞内的聚羟基脂肪酸（PHAs）；然后PHA作为电子供体且氧气（或硝酸盐）作为电子受体，吸收正磷酸盐（过量“摄磷”）以补充聚磷酸盐。这样一来，在缺氧/好氧的环境下就会达到净“除磷”的效果（除磷量=吸磷量-释磷量）（Oehmen等人，2007；Henze，2008）。值得注意的是当聚磷菌作为剩余污泥排出生物反应器时，可以通过化学萃取和沉淀回收磷（Acevedo等人，2015；Salehi等人，2018）。
然而，上述的传统EBPR（CEBPR）在温暖气候的海滨城市里应用是比较困难的，例如香港废水的特性就是具有相当高的温度（30℃）和盐浓度（1%）（Wu等人，2014）。被开发用来处理低温废水（5-25℃）的CEBPR工艺不能很好地处理高温废水（＞30℃），原因主要来自聚糖原菌（GAOs）竞争，这类微生物能在厌氧环境下快速地将VFAs转化为PHAs（在高温下比PAOs作用更为迅速），同时还能在有氧环境下积累糖原而非聚磷酸盐（Panswad等人，2003；Whang and Park，2006；Lopez-Vazquez等人，2008，2009；Oehmen等人，2010）。由于这个原因，GAO的数量在温暖地区的活性污泥工艺中占据优势（Cao等人，2011；Ong等人，2014）。而且，CEBPR工艺会受高盐度和硫酸盐浓度的负面影响。这样高的盐度（氯化物平均浓度为5000mg/L）和硫酸盐浓度（硫酸盐浓度为50-500mg SO4- /L）条件是由于海水/微咸水的直接使用和渗透（Bear等人，1999；Guo等人，2019；Hao等人，2014）。高盐度环境（Welles等人，2014）和厌氧硫酸盐还原产生的高浓度硫化物会(Yamamoto-Ikemoto等人，1991，Saad等人，2017)对PAOs性能产生不利影响。
选择一个在适度温度下竞争性优于GAO，且能忍受高盐度和高硫酸盐浓度的另类PAO，就可以呈现一种可以克服前面所述困难的方法（Ong等人，2014；Welles等人，2014）。由于受到硫酸盐在海洋沉积物中引起释P的研究的启发，我们的团队最近开发了一种新型硫循环相关联的生物工艺，命名为伴生反硝化的硫转化ESPR工艺。在这个工艺中，功能性细菌（硫酸盐还原菌（SRB））和硫化物氧化菌（SOB）可以协同作用来吸收VFAs，还原硫元素化合物，生成PHAs和聚硫化物/元素硫（聚硫），这些物质能在香港地区处理含盐废水的背景下保持较低的污泥产量，并为同步除C、N、P提供电子供体/能量来源（Wu等人，2014；Yu等人，2016；Guo，2016）。而且，SRB和SOB组成的协同体在以硫转化为中心的EBPR工艺（SEBPR）在与GAO的竞争中占据优势，当pH呈中性（7.0-7.5）且温度高（25-30℃）时尤其如此(Guo等人，2017，2018)。因此在我们前面的研究中，我们推测与硫循环相关的EBPR可以专门将碳循环驱动的聚磷酸盐积累转化成硫循环驱动的机制(Guo等人，2017，2018)。大约有一半的挥发性脂肪酸中的碳仍然经过VFA→PHA→CO2/糖原的碳循环路线，在这个过程中将会为聚磷酸盐的积累而生成三磷酸腺苷（ATP）。因此，我们不清楚有多少由聚磷酸盐积累而产生的ATP会来自于硫转化（图. 1a）。
为了认识硫驱动的机制，我们开发了一种新型的硫循环相关的EBPR体系，它几乎可以只依赖于硫的氧化还原循环并消除前述碳循环的影响。我们称它为SEBPR（图. 1b）。新型SEBPR于一个在厌氧和缺氧模式的工况下交替运作的序批式反应器（SBR）中持续运行了120天，其目的是处理高温（30℃）和高盐度（6000mg/L Cl-）的废水。通过观测SBR和进行附加批次试验，我们发现了这个体系的性能和硫-磷之间的转化现象。通过微观分析，我们发现了关键的功能性胞内聚合物(比如聚硫和聚磷酸盐)。这种SEBPR中的功能群体是通过结合流动式细胞光度法细胞分选，基因空间分离和16S DNA高通量测序的技术被发现的。这种新型微生物群落的宏基因租特性也被分析出来了。
2. 方法和材料
2.1. 反应器设计和运行条件
用于这项研究的实验室规格的SBR是由不透明的PVC制作的，如附图S1所示，其反应区的体积为20L，顶部空间有10L。反应器被严密覆盖，持续运行了120天且呈完全混合式（使用每分钟120转的机械搅拌器）。反应器的运行分为两个阶段——启动阶段（阶段一，0-40天）和稳定运行阶段（阶段二，41-120天）。接种污泥是从当地的含盐污水处理厂（沙田污水处理厂）的厌氧污泥消化池中收集的。遵循Wu等人(2014)的方法，使SBR在厌氧/缺氧的条件下交替运行，目的是为了开发SEBPR。
将合成的含盐废水作为进水，在我们先前的研究中(Wu等人，2014)，它含有400 mg COD/L，60mg/L NH4 -N/L和20mg PO43--P/L。仅有的有机碳来源为醋酸钠（相当于150mg C/L）。添加一定量（4L）的实际厕所冲洗海水，相当于总需水量的20%（20L），以提供硫源并模拟香港的含盐污水（硫酸盐浓度：135.8plusmn;26.3 mg S/L）。关于海水组成的额外信息可以在其他地方查找(Dai等人，2014)。反应器的循环运行分为6步进行（在图. S2也有描述）：第一步（进水废水）：将10L合成废水加入SBR（进水时间：10min）。第二步（混合，厌氧阶段开始和反应）：使用机械搅拌（120转/分）进行混合，然后开始厌氧阶段，其中硫酸盐还原和磷释放是主要反应。第三步（投加硝酸盐）：将硝酸钠（NO3—N 1g/L）溶液通过泵加入反应器。第四步（缺氧阶段开始和反应）：加入硝酸盐后，缺氧阶段开始，反硝化作用、硫酸盐再生和磷吸收应该是主要反应。第五步（沉降）：当磷酸盐和硝酸盐在本体液体中全部消耗完时，缺氧阶段终止，机械搅拌器停止来使污泥沉降近1小时。第六步（倒水）：10 L出水被倒出。以上六个步骤在每个循环中重复。表1给出了一个周期内各个步骤的醋酸盐、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐的浓度。在起始阶段（阶段1）中，确定了厌氧阶段的持续期间，以保证碳源（电子供体）被全部消耗且磷不再被释放(Wu等人，2013)。当体系达到稳定运行的条件时（阶段2），厌氧阶段和缺氧阶段的持续时间被分别控制在12小时和24小时。在整个过程中，pH值用pH控制器控制在6.9和7.9之间，反应器温度控制在30℃。，在这个体系中没有刻意去浪费污泥，尽管有一些污泥通过出水和作为分析的常规样本流失了。应萃取SEBPR中富集磷的剩余污泥，并将其转移到一个磷沉淀池中进行资源回收(Wu等人，2013)。需要提及的是厌氧和缺氧阶段两者的溶解氧（DO）浓度都要在0.05mg/L以下。
在适当的采样时间间隔下采集污水样本以测定各种参数，如磷酸盐、醋酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫化物、聚硫化物、硫代硫酸盐、液相镁和液态钾，以及混合液挥发性悬浮固体浓度（MLVSS）、混合液悬浮固体浓度（MLSS）、聚硫、多磷酸盐、PHA，和固相的糖原。系统在第二阶段达到伪稳态，此时上述参数的浓度不再发生显著变化。然后在SBR中进行原位循环试验（每个运行循环过程中每2小时取样一次），以研究系统在第90天的循环行为。
（a）碳-硫转化的混合式EBPR （b）（本实验中）硫转化为中心的EBPR
图1. 两个硫循环相关的EBPR工艺的概念图（应注意的是，在SEBPR（图. 1b）中，醋酸碳的一小部分作为难以描述的中间化合物储存在细胞中，而不是PHA和糖原，这应该会在未来确定。）
表1.
SBR运行性能（平均值plusmn;标准偏差值）
2.2. 附加批次试验
为了揭示硫循环在P释放和吸收还有聚磷酸盐富集中的作用，我们在30℃以下进行了两组批次试验，两组试验硫酸盐的初始浓度为10和90mg SO4-S/L。选用所报道的两种硫酸盐的浓度主要是为了模拟实际海滨城市的含盐废水中硫酸盐浓度在50-500mgSO42-/L之间的情况，即16.7-166.7mgSO4-S/L（平均浓度为91.7 mg SO4-S/L）。因此，10mg SO4-S/L被视为最低水平，90 mg SO4-S/L被视为最高值（接近平均浓度）。两个4L的间歇反应器采用相同的设计，配有pH控制器（6.9-7.9）、温度控制器和机械混合器，用于批次试验（命名为BT-A和BT-B；见图.S3）。进入SBR的合成废水也用于批次试验。为了使硫酸盐浓度成为被控制的唯一变量，使用加入硫酸钠和氯化钠溶液（6000cl mg/L）的去离子水代替真实海水。在缺氧阶段（第90天）从SBR中抽出8L污泥，进行批次试验之前用超纯水彻底洗涤三次。洗涤后的污泥在两个间歇反应器之间平均分配。每项试验进行三次，以保证试验的可重复性。这些试验在连续不断的天数内进行，因此可以忽略微生物群体的变化。进行完分批试验后，污泥返回到SBR中。
2.3. 化学分析
用WTW万用仪（Multi 3
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