对ISCR的研究揭示了金属依赖性调控DNA结合特异性的独特机制外文翻译资料

 2022-08-15 14:52:07

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对ISCR的研究揭示了金属依赖性调控DNA结合特异性的独特机制

SenapathyRajagopalan,莎拉.杰特,PetrusHZwart,RichardGBrennan,凯文.J.菲利普斯,帕特里夏.杰.凯利

来自大肠杆菌的ISCR是一种不寻常的金属调节剂，因为APO和铁硫(Fe-S)-ISCR都调节转录，并表现出不同的DNA结合特异性。在这里，我们报告了ISCR的结构和生化研究，表明Fe-S连接后蛋白质-DNA界面的重塑拓宽了ISCR的DNA结合特异性，从仅将2型模体结合到1型和2型模体。对具有松弛靶位判别的apo-IscR变体的分析确定了野生型apo-IscR中的一个关键残基，我们建议，与1型模体进行不利的相互作用。在Fe-S结合时，这些相互作用显然被移除，从而允许ISCR结合1型和2型模体。这些数据表明配体介导的DNA位点识别的独特机制，即金属簇连接重新定位蛋白质特异性决定簇以扩大DNA靶位点选择，从而允许holo-IscR的更广泛的转录反应。

Fe-S蛋白是一种古老的蛋白质，存在于生命的各个王国。它们在基因组维持、转录、翻译和代谢中具有关键的结构、催化或电子转移作用。一些最近发现的调节蛋白利用Fe-S簇作为各种小分子的传感器，利用这些金属中心的多功能化学反应活性。研究良好的调节剂[4Fe-4S]-FNR的调节反应是大多数金属调节因子的典型，其中同源金属中心的结合将转录因子从非活性状态切换到活性状态，并相应地改变其调节因子的表达。相比之下，大肠杆菌[2Fe-2S]转录因子ISCR已成为一种不寻常的Tran转录调节剂，由于其无簇形式(APO-ISCR)和[2Fe-2S]结合形式都是活性转录调节剂。簇连接明显改变了DNA结合的特异性，从而改变了IscR控制的基因集。

ISCR在细菌中广泛保守是大的Rrf2家族的一部分，有翼螺旋-转螺旋(WHTH)转录因子。它首先被发现为ISC操纵子的负自调节因子，编码ISCR和ISCFe-S生物发生途径的成员。然而，现在已经知道IscR是一个直接或间接控制40个基因表达的全球调节因子。对ISCR调控基因的分析表明，ISCR识别1型和2型DNA结合模体，这取决于[2Fe-2S]簇是否与蛋白质连接。只有[2Fe-2S]-IscR结合1型位点，而[2Fe-2S]-ISCR和APO-ISCR都结合了具有相似高亲和力的2型位点表示Fe-S簇不需要与2型位点交互。的IscR辨别能力在两个DNA模体之间是出乎意料的，因为ISCR的预测结构只包含一个wHTHDNA结合结构域，而其他已知的含有Fe-S簇的转录因子(例如FNR和SoxR)在缺乏金属簇时似乎不能调节转录。在[2Fe-2S]簇连接时，IscR靶位识别的特征和改变IscRDNA结合特异性的结构变化是未知的。

为了深入了解IscR如何识别两种不同的DNA模体，我们使用了X射线晶体学和结构导向突变。我们结晶了一个缺乏Fe-S簇的IscR突变体，它与编码氢化酶-1的hya操纵子启动子的一个研究良好的2型位点结合。根据IscR-hya的结构

复合物，我们在介导蛋白质-DNA相互作用的关键残基处进行丙氨酸替换，并测定每个蛋白质变体的[2Fe-2S]结合和载脂蛋白形式结合1型和2型位点的能力。我们发现Glu43的侧链是一个主要的鉴别器，允许ApoISCR区分1型和2型结合位点。这些研究提示了一种以前未知的DNA结合转录因子的金属依赖性调控机制，其中DNA结合特异性明显被金属辅因子连接后的单键侧链的重新连接所拓宽。

结果

与2型DNA位点结合的apo-IscR的结构

我们利用扩展到分辨率的数据，确定了IscR与含有Hya启动子(IscRhya)2型结合位点的DNA(Hya)的29碱基对(29-bp)片段的晶体结构为2.22A。为了解决这一结构，我们使用了ISCR变体(ISCR-3CA)，其中簇协调半胱氨酸(Cys92、Cys98和Cys104)被替换为Alanines，以确保该蛋白缺乏Fe-S簇。在体外，ISCR-3CA的hya结合亲和力与野生型ISCR相似，在体内抑制hya启动子方面具有充分的功能。在P2中结晶ISCR-3CA12121空间群和不对称单元包含一个ISCR-3CA同二聚体，从HYA位点结合到单个双链DNA。同二聚体的两个IscR-3CA亚基几乎相同，具有r.m.s。偏差为0.6A。IscR-3CA主要是alpha;-螺旋结构，由两个主要结构元素组成：DNA结合区和二聚螺旋。二聚体的稳定主要是通过二聚螺旋螺旋（残基103-123）的卷曲线圈残基以及螺旋alpha;1（残基5-20）和alpha;6（残基126-134）之间的疏水相互作用实现的，在两个单体之间掩埋了约34002A的溶剂可及表面积。螺旋alpha;2（残基25–32）、alpha;3（残基36–42）、beta;-链beta;1（残基49–52）、beta;2（残基53–57）和翼W1（残基59–61）形成wHTH DNA识别模体。IscR-3CA相对较长的二聚螺旋位于二聚体末端的DNA结合区，使每个单体的识别螺旋与DNA的连续主槽相互作用，翼与相邻的凹槽相互作用。该体系结构与ISCRDNA足迹27bp一致。包括两个对称相关的半位显示突变是重要的结合。

在野生型IscR中，包含参与[2Fe-2S]簇连接的残基的电子密度在两个蛋白链中只有一个是明显的。电子密度的位置表明这些丙氨酸残基（92、98和104）在这种构象中是溶剂暴露的。如果类似的半胱氨酸残基的位置相似，并且溶剂以配体结合的形式暴露在IscR中，那么这个位置可以允许[2Fe-2S]簇的容易进入和/或丢失，为理解这个蛋白质在感知细胞Fe-Scluster状态中的功能提供了一个框架。另外，来自一个亚单位的簇结合位点靠近另一个亚单位的DNA结合域，表明一个IscR亚单位的Fe-S簇连接可能影响另一个亚单位的构象和DNA结合。

与理想的B型DNA相比，ISCR-3CA结合的HyaDNA弯曲~8.4°。而整体DNA略欠扭曲(HYA为33。1°，而典型B-DNA为35-36°)。将ISCR-3CA的识别螺旋插入主槽，使B型DNA的主槽从11.0A扩大到14.3A核苷酸位置9、10和11。然而，ISCR-3CA-Hya复合物中DNA的总体结构与理想的B-DNA没有明显的差异。

通过apo-IscR识别hya靶点。

我们发现ISCR-3CA具有一个基本的表面，包括识别螺旋和翅膀，它结合DNA。然而，ISCR-3CA-Hya界面的一个显著特征是在这个基本的DNA结合表面的中间存在一个保守的谷氨酸，Glu43，这使得从识别螺旋延伸的侧链羧基与C7C8和C7的外环胺之间发生双齿相互作用a8。酸性残基通常不参与DNA碱基识别，因为具有电负性DNA骨架的静电排斥潜力(尽管有几个例子，包括分解代谢激活蛋白CAPDNA复制引发蛋白RepE-DNA更常见的是锌簇家族中的蛋白质-DNA复合物已报告)。此外，识别螺旋Ser40的羟基与A20和G20的N7形成氢键提出了一个原理，以保护嘌呤在位置20在两个半点的Hya位点。识别螺旋的Gln44侧链。

结构还表明，ISCR-3CA的wHTH结构域的翼深入扩展到hya的小凹槽中，以提供额外的特异性和稳定性。Arg59的侧链延伸到凹槽，其胍基与T6和T25的羰基氧基相互作用。IscR-3CA的hya结合结构提供了对GXXGG模体的深入了解，GXXGG模体在较大的Rrf2家族中，在IscR同源物和蛋白质(如CymR)中都是保守的。Gly60和Gly64被发现存在于其中的构象中只有甘氨酸的Ramachandran空间区域，禁止它们对其他残基的突变，并符合翼内60GXXGG64模体的守恒。此外，该结构表明，Gly60和Gly63必须是甘氨酸的空间原因，因为存在一个C碳会在翼和DNA或DNA之间产生空间冲突分别为1股。值得注意的是，虽然CymR和IscR-3CA之间有相似的非结构化区域。

和在识别螺旋中的三个残基中，有两个在ISCR-3CA和相似的整体褶皱中产生碱基特异性接触，CymR的二聚螺旋的长度和空间取向不同。因此，即使CymR的DNA识别应该与IscR的DNA识别非常相似，CymR结合可能需要蛋白质、DNA或两者的构象变化，正如前面所建议的那样。其他ISCR-3CA-Hya相互作用包括Tyr41，形成a与G18糖基的堆积相互作用和与同一核苷酸的主链磷酸盐的氢键。这种相互作用可能有助于扩大主槽的这个区域的宽度，以稳定识别螺旋的插入。在C7位置，Tyr65与磷酸盐形成氢键和Arg2，Thr4，Ser5，Leu28，Ser38，Arg50和Ser57与磷酸盐骨架进行了额外的接触。

ISCR在hyaDNA结合上的结构变化

为了评估ISCR-3CA与hya启动子结合时的构象变化，我们还在没有DNA的情况下结晶了ISCR-3CA结构在P3中得到2空间组，并使用扩展到1.9A分辨率的数据确定。与以前的报道一致，IscR在溶液中表现为二聚体，ISCR-3CA不结合DNA结晶为同二聚体。游离和hya结合的ISCR-3CA的类似寡聚状态表明，ISCRDNA结合的调控不同于FNR家族的Fe-S转录因子，其中簇诱导的二聚通常控制DNA结合，比较了ISCR-3CA在和DNA结合的形式表明，未结合的ISCR-3CA具有与ISCR-3CA-hya相同的一般结构。二聚体的两个亚基是相对于彼此旋转20°，导致DNA识别螺旋将其定位在主槽中。除了Glu43，它在绑定时旋转，允许它接触C7C8和C7a8只有轻微的旋转位移是必要的，以适应ISCR-3CA与HYA启动子的结合。一般来说，ISCR-3CA翼的残基在DNA结合时几乎没有发生结构变化，只是Arg59的侧链没有明显的电子密度结构，在与Hya的结合后被指挥。参与DNA相互作用的残基结构中IscR-3CA侧链接触的核苷酸碱基与先前被认为对HYA位点突变分析具有重要意义的碱基很好地对应。然而，由于ISCR结合亲和力的降低，突变的hya位点可能是由于核苷酸接触的去除和（或）核苷酸空间阻碍相互作用。

在具有DNA的ISCR侧链中，这些先前的结果可能掩盖了单个核苷酸的相关贡献。为了独立地评估每个侧链-核苷酸的相互作用，我们通过单独地用丙氨酸取代Arg59、Tyr41、Ser40、Gln44或Glu43来去除侧链接触，并了EDTA处理的分离蛋白的结合亲和力，以获得APO形式。我们发现，与野生型蛋白相比，大多数变异的ISCR蛋白与hya位点结合的亲和力降低，表明这些侧链的关键作用。我们观察到Arg59丙氨酸取代之后亲和力降低，表明翼模体的Arg59侧链对结合亲和力作出了主要贡献，部分是通过与富含AT而形成静电相互作用。在那里ge;3bp与狭窄的凹槽的存在相关，这些凹槽通常被精氨酸残基识别。这一结果与以前的调查结果一致这表明，在HYA位点的凹槽AT束内的GC碱基对突变解除了ISCR结合。Tyr41似乎也对DNA结合作出了实质性的贡献，因为在这个位置的丙氨酸取代降低了结合亲和力。这些结果与Tyr41-DNA相互作用一致，提供了结合能，以稳定识别螺旋在主槽。

我们还发现，去除三个ISCR残基的侧链，使碱基特异性相互作用-Ser40，Gln44和Glu43-对DNA结合亲和力有不同的影响。丙氨酸取代Ser40导致结合亲和力适度降低，与Ser40侧链在20和20处识别嘌呤的N7中的作用一致。在HYA位点第20位的嘌呤-拓扑嘧啶取代解除ISCR结合。与T19和T19的Gln44的相互作用似乎没有在与2型模体的结合亲和力中起主要作用，因为Gln44的丙氨酸取代只导致与hya位点结合的缺陷。胸腺嘧啶在19号和19号位置和在2型模体中保守性差，在hya位点的这些位置突变也会导致轻微的结合缺陷。值得注意的是，Glu43的丙氨酸取代对结合亲和力影响不大。尽管利用其羧酸盐侧链与C7C8的N4和C7的N4形成氢键和A8的N6。我们对这一结果感到惊讶，因为hya位点的这些位置的突变显著降低了野生型IscR的结合。

ISCR-E43A失去了对C7C8二核苷酸的鉴别

对IscRE43A变体(IscR)行为的可能解释是消除了Glu43的羧酸盐侧链这些位点的特异性，而不改变结合亲和力。事实上，与野生型ISCR不同，我们发现ISCR-E43A在位置7或8的核苷酸碱基之间没有区分核苷酸碱基，因为半个位点的C7C8突变不像野生型IscR那样破坏结合亲和力，就像它们与野生型ISCR一样。这些结果表明，Glu43接触对识别2型位点的两个半位点中保存良好的CC二核苷酸至关重要。用ISCRE43A和突变型HYA模板进行的附加结合实验表明，尽管对对称的CC二核苷酸失去特异性，但ISCR-E43A在HYA位点的其他保守位置保持与野生型ISCR相同的特异性，并以与野生型ISCR相同的方式与HYA位点结合，如E43Ahya复合物的结构所示。最后，hya的一半位点含有C7′A8′，而不是保守的CC二核苷酸。A8′对胞嘧啶的突变略微提高了结合亲和力（数据未显示），这与Glu43识别的对称CC二核苷酸优先出现在2型位点的两个半位点的位置7和8一致。

ISCR使用Glu43来区分1型模体

与ISCR2型位点相反，1型结合位点是不对称的，在一个半位点和一个T7中含有C7C8二核苷酸t8另一半部位的二核苷酸。因为apo-IscR与2型模体结合，而不是1型模体结合，我们考虑了Glu43与T7的抑制相互作用的可能性t8在1型模体中的二核苷酸阻止APOISCR结合。因此，我们比较了apo-IscR、[2Fe-2S]-IscR、apo-IscR-E43A和[2Fe-2S]-IscR-E43A与来自ISC启动子(ISCRB)的1型位点结合的能力。如预期的那样与[2Fe-2S]-ISCR相比，APO-ISCR结合了ISCRB型1位点。相反，APO-ISCR-E43A强烈地结合了ISCRB型1位点，类似于[2Fe-2S]-ISCR-E43A和野生型[2Fe-2S]-ISCR。这种亲和力

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