重组Tau蛋白的纯化及在体外对阿尔茨海默病相关的螺旋细丝的制备外文翻译资料

 2022-09-15 14:54:13

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重组Tau蛋白的纯化及在体外对阿尔茨海默病相关的螺旋细丝的制备

摘要

Tau蛋白是一种神经微管相关蛋白。除了其生理功能即结合和稳定微管，tau蛋白在阿尔茨海默病患者的大脑中以不溶性纤维被发现，即所谓的“双螺旋丝”（PHFs）。通过调查tau聚合的原理来寻求抑制条件或化合物以达到预防PHF的形成是必要的，这可能会减缓甚至阻止阿尔茨海默病神经元变性。在这一章中，我们描述了研究tau聚合特点的必要措施。

这些措施包括：对表达重组tau蛋白的纯化方案；聚阴离子诱导蛋白聚合成双螺旋丝的一般方法；通过一个基于荧光的检测方法对PHFs定量分析；使用透射电子显微镜采用负染技术对双螺旋丝成像并验证。

关键词：阿尔茨海默病；tau蛋白；双螺旋丝；纯化；阴离子聚合；硫黄素-S法；电子显微镜；淀粉体

1.简介

阿尔茨海默病以两种类型的病理蛋白沉淀为特征，一种是阿尔茨海默病的淀粉样纤维组成的淀粉样蛋白Aszlig;（Aszlig;）肽，导致产生淀粉样斑块，另一种是导致神经原纤维缠结（NFTs）的tau蛋白纤维（成对螺旋丝）。Aszlig;肽具有部分疏水性。而tau蛋白由于它的亲水性特征是高度可溶的。在这两种情况下，纤维的组建原则仍然是一个争论的问题。Tau主要存在于神经元的轴突隔室。在人的中枢神经系统中，它存在于17号染色体上，它的6个异构体来自于一个单一基因的选择性剪接体中。Tau的功能是结合和稳定的微管，作为轴突运输过程中运动蛋白的轨道。Tau蛋白的N-末端的一半离开微管表面，而C-末端结合到微管上。tau的C-末端结构域包含3或4个伪重复结构，约31个残基（见图1），它们对微管的结合很重要，以及病理性聚集成PHFs。

单体tau蛋白在溶液中的二级结构尤其是PHFs中的tau蛋白是长期以来一直争论的一个问题。总之，单体Tau表现出的圆二色性（CD）的频谱，是占主导地位的一个随机线圈图案，与亲水性氨基酸组成相一致。tau蛋白序列中的一些肽采用alpha;螺旋构象，但只存在于含螺旋诱导剂的非生理缓冲液中。早期对PHFs中Tau的研究用NFTS的 X-射线纤维图或重组tau的纤维图表明在szlig;结构上显示出较弱或无关的情况，另外，与硫磺素-S相比，刚果红染料对神经原纤维缠结和tau蛋白纤维染色较差，这一种被认为是跨szlig;-结构染料。只有最近研究表明在tau的聚合成PHF的过程中从无规卷曲结构的转变beta;-结构有增加的趋势。

类似于阿尔茨海默病，PHFs体外制备最近受到一个聚集率缓慢和收益率低的阻碍。这个问题可以用不同的方法来克服：

（一）使用某些阴离子辅因子增加反应速率，如聚阴离子（如肝素、聚谷氨酸和RNA）或脂肪酸（如花生四烯酸）；

（二）限制tau某些特定领域，如单独重复域聚集比全长tau更容易进入PHFs纤维；

（三）通过引入额颞叶痴呆症发生的突变（FTDP-17），如ak280 P301L，导致加速或增加PHF的聚集。

总的来说，tau蛋白病理聚集可以作为成核伸长反应并涉及围绕重复域中六肽基序形成szlig;结构。tau蛋白重复结构域是足够形成PHFs并形成tau蛋白重组为重组纤维的核心，类似于老年痴呆症的大脑纤维。电流聚集分析利用任一阴离子或脂肪酸，它们在氧化还原条件下进行。在这一章中，我们将描述纯化重组表达tau蛋白的一般方法和PHFs中tau蛋白异构体的一般制备方法。我们将进一步强调tau蛋白重复结构和氧化、还原条件对形成的PHF的影响。

方法现已可用，在溶液和实时PHF聚集产生良好的估计，如添加报告染料的荧光（硫黄素-S [ThS]）或光散射。我们将在本章通过ThS分析监测PHF叠合。

现实的装配条件的判断取决于电子显微镜，它会说明纤维是否是“双螺旋”，因为其典型的80nm交叉重复、宽约10到20纳米特点，是老年痴呆症的特征。直细丝可以形成，但在这种情况下，与其他类型和聚合途径的区别是不明确的。通过电子显微镜或整体外观检验和影像将作为这一章的最后方法。总之，讲述了重组tau蛋白和老年痴呆症产生的类似双螺旋丝体外纯化及其验证的主要方式。

2.材料

2.1.蛋白表达和纯化

1.一般HPLC设备：如高效液相色谱仪、进样环路（50-150毫升），样品收集器等。

2.凝胶渗透色谱柱。

3.阳离子交换色谱柱

4.透析管（3.5 kDa分子量切断）。

5.弗氏细胞压碎器。

6.SDS-PAGE电泳设备。

7.细菌细胞颗粒悬浮液：20 mM MES, 1 mM EGTA, 0.2 mM MgCIbdquo; 5 mM二硫苏糖醇(DTT), 1 mM苯甲基磺酰氟化物，10mu;g/ml亮肽酶素，2 mM胃蛋白酶A，pH值6.8。添加DTT，PMSF，肽酶，胃蛋白酶A，现加胃酶抑素。

8.阳离子交换层析缓冲液A：20 mMMES,50 mMNaC1.1 mMWiTA,1 mMMgC12,Z mMDTT (现加), 0.1 mMPMSF (现加), pH 6.8。

9.阳离子交换层析缓冲液B：20mM MES, 1 M NaC1, 1 mM EGTA,1 mM MgC12,2 mM DTT (现加), 0.1 mM PMSF (现加), pH 6.8。

10.凝胶过滤缓冲：PBS (137 mM NaC1, 3 mM KCI, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2PO4, pH 7.4 )另加 1 mM DTT (现加), pH 7.4。

2.2.成对螺旋丝的制备与验证

1.肝素（分子量 6000Da，西格奥德里奇）。

2.蛋白酶抑制剂:PMSF、EDTA、EGTA、肽酶、抑肽酶和胃蛋白酶A。

3.硫黄素-S（西格玛奥德里奇）。

4.如果这个方法需并行处理的能力：微孔板荧光分光光度计（例如，荧光分光光度计的变化提升，实验室系统，赫尔辛基，芬兰）和黑色的微孔板（例如，386孔板，夹轨底垫板，实验室系统）。

5.负染色透射电子显微镜设备（透射电子显微镜，电子显微镜样品网格[例如，600目碳包覆铜网]，FME镊子[杜蒙特5号]，2%醋酸双氧铀）。

3.方法

这个副标题将涵盖以下主题：

1）大肠杆菌重组表达蛋白的纯化。

2）从Tau蛋白中制备真正的成对螺旋丝的一般方法。

3）一个用于验证和监测由Tau蛋白形成的成对螺旋丝形成的动力学的方法的简要概述。

3.1.Tau蛋白纯化

Tau蛋白在大肠杆菌BL21中可大量诱导表达。pNG2载体作为表达载体使用，它是PET-3载体的衍生物。从10升培养体积，收集约10到100毫克的蛋白质，根据不同的亚型或Tau结构，可以预期纯化后纯度为95%。

1.通过离心收集细菌细胞后，细胞颗粒悬浮在冰冷的细菌细胞颗粒悬浮液中。采取的样品和tau蛋白用SDS-PAGE分析（见图2，4泳道）。

2.悬浮细胞也可以直接提取到透析阶段（步骤6）即高效液相色谱法测定透析前，冻结在20°C存储以供进一步处理。

3. 使用弗氏细胞压碎器破碎细胞两次（保证任何时候冰浴条件下裂解细胞防止蛋白迅速降解！）用SDS-PAGE分析tau蛋白（见图2，5泳道）

4.加入NaCl至终浓度为500 mM并煮沸20分钟，通过处理除了tau蛋白几乎所有的蛋白质都变性，停留在溶液并维持其生理功能

5.颗粒变性的蛋白质和细胞碎片通过离心127000g 40 min 4c.取上清液的等分试样和SDS-PAGE tau蛋白颗粒分析（见图2，6泳道）。

6.上清装入液透析管（截留分子量3.5kD）并交替使用两种阳离子交换层析缓冲液透析过夜（见目2。）在4°C在不断搅拌下（第一次换缓冲液应在透析2 h后，见注1）

7. 通过离心清洗的透析液，在4c 127000g40分钟.采取等分通过的SDS-PAGE分析tau蛋白。

8清晰的上清液装在一个阳离子交换色谱柱上使用。（见注2）

9. 用3至5倍柱体积阳离子交换色谱缓冲液洗非特异性蛋白直到紫外吸收达到一个稳定值。

10. 依次使用6倍柱体积终浓度60%的阳离子交换层析缓冲液B洗脱tau蛋白（见注3）。取等分含蛋白质的洗脱组分做紫外吸收和tau蛋白的SDS-PAGE分析（见图2，7泳道）。

11. 制备含有tau蛋白的池样品并使用超滤装置浓缩（如ULTRAFREE，微孔；10 kDa MWCO为tau蛋白异构体和5 kDa MWCO为短时间重复结构）至最终体积0.5至1毫升含有5至10毫克的tau蛋白（如用Bradford法测定）。采取等分的样品使用SDS-PAGE分析tau蛋白。

12.将tau蛋白浓缩到一个低流速（如0.5Mn）的凝胶过滤缓冲液中的凝胶过滤柱上。洗脱蛋白质后，可以增加的流量，更快地完成的运行。以等分含蛋白质的洗脱组分作紫外吸收判断和SDS-PAGE分析tau蛋白。

13.取合适纯度的一部分降解的tau蛋白组分（见注4）和tau蛋白二聚体（见注5）。确定蛋白质的含量（见注6）并储存分装在-80℃。用SDS-PAGE检查等分池样品的纯度并作为参照。

3.2．Tau蛋白的成对螺旋丝的制备

在副标题3.2.1，我们将通过在还原条件最长的tau蛋白异构体的制备hTau40（4次重复的亚型）和最短htau23（一个3重复tau蛋白异构体异构体）讲述Tau蛋白的成对螺旋丝的制备（见图1）。在第二部分（见副标题3.2.2）我们将重点在还原或氧化条件下从3重复和4重复的Tau重复结构域制备PHFs。根据Tau亚型或Tau重复域结构，在体外制备的真正的配对螺旋丝的时间框架分别为几小时至2周的时间。在任何情况下，PHFs聚合的辅助因子肝素都会大大提高tau蛋白的聚合速度（见注7）。

3.2.1从Tau亚型中制备成对螺旋丝

1.任何动力学分析PHF聚集之前，通过SDS-PAGE检查所使用的tau蛋白为同等的浓度、纯度、降解度和可能的二聚化（低聚）。这大大影响tau聚合成PHFs的 效率（见附注5及6）。

2.Tau聚合的条件是：50mu;MTau亚型蛋白，12.5mu;M肝素和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，1mM EDTA，1mM EGTA，1mu;g/ml肽酶、mu;g/ml抑肽酶和mu;g/ml胃蛋白酶。作为一个PBS缓冲液含2 mM DTT ,PH是7.4。

3.保存在37℃。

4．在适当的时候检查PHF装配（见图3）采用ThS荧光（见标题33.1）和透射电镜（见副标题3.3.2。）。它可能需要长达2周达到tau PHF聚合的最终值（见图3）。

5。如果聚合的是一个4重复结构tau蛋白，保持每天加入1 mM DTT的还原条件（见注6）。

3.2.2Tau重复结构域的成对螺旋丝的制备

1.任何动力学分析PHF聚集之前，通过SDS-PAGE检查所使用的tau蛋白为同等的浓度、纯度、降解度和可能的二聚化（低聚）。这大大影响tau聚合成PHFs的 效率（见附注5及6）。

2.tau蛋白重复域聚合的条件是：20 mu;MTau，在5mu;M肝素的PBS或不含1 mu;M DTT，pH 7.4（见注6）。

3.保存在37°C.

4. 使用ThS荧光定期检查PHF的聚合量（见副标题3.3.1）和透射电子显微镜（见目3.3.2。）。它可能需要长达3 d达到tau PHF聚合最终值（见图4）。

3.3.成对螺旋丝聚合的验证

首先，我们将描述对tau蛋白聚合成PHF的一种手段，研究tau PHF聚合动力学（见3.3.1子目。）。在接下来的部分，通过用负染色透射电镜PHF形成成像的证明（见3.3.2副标题。）。

3.3.1.成对螺旋丝的定量分析

使用硫黄素-S荧光法

硫黄素-S荧光法可用于为了证明Tau聚合成PHF。染料结合PHF，从而导致荧光发射光谱的变化。用荧光光谱仪可以测定发射荧光的强度，并对溶液中PHF定量测量。tau蛋白的单体，二聚体，或非结构化较高的聚合形式不会导致荧光移位。因此，这个方法可以用来验证即使在适合的聚合动力学研究定量tau 聚合成PHF的方式（见图3和4）。这里不同与ThT的是，ThT经常使用于Aszlig;纤维溶液定量，见注8。

1. 在一个黑色的386微孔板中准备总体积为50试验溶液，包含10mu;M ThS,5-15mu;M在PBS中PHF聚集样品的tau蛋白，pH值7.4。

2.作为一个背景荧光，光散射与荧光相互作用单体Tau或肝素，准备以下加入适量到ThS化验样品中：

（一）只有缓冲液，

（二）只有Tau蛋白，

（三）只有肝素（最好准备和孵化这些与tau聚合样品同时的控件）。

3. 在黑暗中室温下把这个实验样品孵育结合45 min保证ThS与PHF结合。

4.测量荧光激发波长为440纳米，发射波长为105纳米。

5.减去背景测量值（缓冲液）从PHF聚集样本中计算PHF具体THS荧光值。

3.3.2. 负染色透射电子显微镜的双螺旋细丝的成像

PHF形成过程中THS荧光变化是对测量从tau蛋白形成PHF一个很好的指标。然而，这并不足以证明PHF形成，tau蛋白聚集体的晶态结构也是导致该荧光增加。因此，探讨PHF的整体外观，通过电镜（EM）负染分析PHF聚集样本是必要的（见图5）。这是超出本章的范围来描述电磁网格的制备和EM的使用，我们只能简略地描述用醋酸铀负染色法处理PHF的流程

1.取等分PHF样品试样，用水调整至10mu;L使其含有1到10mu;M的总tau蛋白。

2.用移液管移到一个干净的封口膜表面配成以下 10mu;L的溶液：一滴tau蛋白的PHF溶液，2滴水和1滴2%醋酸双氧铀（

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