新型结合受体——可逆的点击化学和化学触发去点击反应结合胺类和硫醇类化合物外文翻译资料

 2022-10-08 10:16:25

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新型结合受体——可逆的点击化学和化学触发去点击反应结合胺类和硫醇类化合物

摘要：分子单元的偶联和去偶联是有机化学的基本任务。在本文中，我们研究了使用非常简单的共轭受体，即Meldrum酸的衍生物，它可以在中性的水介质条件下依次的“点击”胺和硫醇类化合物。接着，这种连接可以通过化学触发“去点击”反应释放出原来的胺和硫醇。这种反应剂不同于其它交联剂，因为它具有选择性在加入胺后结合受体的亲电性会改变。我们描述这种方法可以用来修饰蛋白质，创建多组分文库和合成寡聚体，并且在可控条件下1可以转化为原来的化合物组分。因其温和的反应条件和易于在各种应用中使用，预测该方法具有多种的用途。

“点击化学”这个词是由Sharpless等人最先提出用来描述不同化学耦合的方法1-4。特指链接模块单元而没有大量的先前衍生化的简单过程，并且反应效率高没有须用色谱法除去的副产物1。点击反应可在对环境友好的溶剂（例如，水）中进行且反应条件温和（如，常温和常压，露天）。如偶联的官能团不是常见的生物结构单元，反应是生物正交的5-7。最经典的实例是在铜（Ⅰ）催化下叠氮化合物和炔烃的环加成形成三唑8-10，即使如今已经开发了许多其它改进其功能的环加成1-3,11,12。除了涉及机械化学13,14、在环境温度下平衡反应物和产物或加热得到完全逆Diels-Alder环加成15-20，这些反应是不可逆的20。相比之下，除了环加成之外的少数偶联反应是可逆的，但是如下所述，衍生自可去偶联的产物是原始反应物的改变形式21-25。作一个单一的对比，这显示肟的连接须在强酸性条件下才能生成得到原始材料26。

在创建动力学上的共价键的过程中27-31,我们研究出一种可逆的1,4-共轭的活化的alpha;，beta;-不饱和羰基的加成31,32，可以增加这种反应的速率，而这个反应通常可能需要几周来平衡28,29,33-36。我们先前方法显示，与单活化alpha;，beta;-不饱和系统相比，双活化共轭受体加快了加成反应。在这些研究中，我们检验了Meldrum的酸衍生物1加成到胺产生2的潜在用途37-39，接着在水介质中更快速地与硫醇进行动态交换（图1）。重要的是，我们预期添加二硫苏糖醇（DTT）可以使原来的胺和原来的硫醇从3中释放出来，这使得我们发现1可以用于“点击”任何足够亲核的胺和硫醇，接着用DTT进行化学触发的“解点击”反应。因此，类似于Sharpless等人用于定义点击反应的条件，我们在本文中定义使用温和商业化试剂的反应为解点击反应，该反应能不受其他干扰地得到原本的耦合的组分，并且能定量。

根据文献的调查显示，去偶联的方法可以采用物理，酶切反应或化学触发，这取决于连接和所涉及的官能团的性质21,22。在先前的连接胺和硫醇的方法中，解离的方法需要除去一个的单元，而硫醇或胺其中一个仍以某种形式依附在连接体上40,41。因此，图1的化学反应式表示首先胺和硫醇进行偶联，接着去耦，其生成原来的反应物。虽然反应不是生物正交的，但它有简单地有选择性地将两个常见的有机结构单元连接在一起的能力，而这些结构单元也是与生物相关的。因此，该试剂具有用于超分子化学，标记体外蛋白质和研究新型材料的潜力。在这里我们将阐述这个反应和它的局限性，以及它在多方面的用途。

化合物1具有独特的选择性是因为它有能偶联胺和硫醇的结构。在水介质中，向化合物1中添加胺使得2比起原来的结合受体（1）具有更小的亲电性，这是因为通过氮和氢化聚氨酯的一部分羰基的共振稳定的作用。因此，胺不具有足够的亲核性来加入可观的量两次，而硫醇可因为其较高的亲核性而反应形成化合物3。该反应性与硫醇和胺的异双功能交联剂的反应性明显不同21。试剂1是同型双功能交联剂，但是与异型双功能交联剂相比，它达到更好的选择性先后连接一个胺和硫醇。1的反应性的另一独特方面是加入硫醇是动力学上的反应。因此，基于所得产物的相对稳定性，引入不同的烷基或芳族的硫醇使得产物（3和4）混合。此外，由于1也可以与两个硫醇加合而不是胺和硫醇，两个硫醇可以用1动态地连接在一起，但这不是本文的重点。

图1：胺和硫醇加合结合受体的一般示意图。 向溶于6:1水/乙腈的1中加入胺导致形成2。接着，MM在N2鼓泡中被另一种硫醇替代，在几小时至几天内产生3（补充资料第1部分给出反应机制）。加入DTT致使几小时内在中性水介质中释放所有组分。

在研究1的反应性时，我们发现它的选择性具有溶剂依赖性。在非质子溶剂如乙腈或二氯甲烷中，第二个胺很容易加至2。然而，在中性的水中，胺不具有足够的亲核性以进行第二次的加入，因为它主要作为共轭酸存在，而硫醇仍然具有亲核性的或有硫醇盐阴离子，这将增加化合物3的产率。因此，反应对pH具有依赖性的，我们发现pH 7-8是最佳范围。在pH值（lt;7）时，具有氨基和巯基这些官能团的亲核形式以低组分分数存在，因此反应进行缓慢。然而，在碱性pH值（gt; 8）下，2基本上不与亲核试剂反应。这似乎是违反直觉的，因为在这些pH值下，胺和硫醇的亲核形式将占优势。然而，2的N-H键的pKa确定为8.9，解释了这种现象（补充资料第6部分）。当化合物2的N-H键被去质子化时，其给电子能力相对于质子化形式被增强，这使得共轭受体是阴离子的并且基本上是非亲电子的。因此，在pHgt; 8下操作不诱导第二个胺在水中加入2，也不加快硫醇的加入。这种pH依赖性意味着可以通过提高pH来避免硫醇干扰（3至4）。

硫醇加扰（从3到4）反应的速率不仅具有溶剂性和pH依赖性，而且还受硫醇的亲核性、温度、鼓泡和脱氧的程度的影响，防止了二硫化物形成。类似地，产率高低也取决于这些相同的问题，其中不断地脱氧和鼓泡（参见下文）作为最重要的策略，使得在几小时至几天的时间内产率高于90％，这取决于硫醇。

当产生硫醇加扰并且甲硫醇（MM）是良好的亲核试剂（它尺寸小且具有比其它烷基硫醇更低的pKa）时，我们发现在敞开的容器中继续吹入N2除去MM气体能改善化合物2和硫醇加合的速度和效率。这通常在通风橱中进行，使MM的气味被暴露而释放出去，从而使试剂在少量可控量的情况下按需求补充溶剂。如预期的，共轭加成的速率取决于胺和硫醇的浓度，温度和亲核性（补充资料第4部分）。例如，将alpha;-Boc-赖氨酸加合到化合物1中，在室温下完成需要近三天，但是在45℃下该反应时间缩短至几小时。在室温下加入4-氨基甲基苯甲酸（一种比赖氨酸更良好的亲核试剂）仅需4小时。对于硫醇，在室温下将N-乙酰半胱氨酸（NAC）加成到1-赖氨酸需要大约两天完成，然而在45℃下将该反应时间缩短至8小时内。然而，尽管加热增加了硫醇加成的速度，但是它也略微增加化合物2的水解程度（用水分子中的羟基取代MM基团），否则在室温下它在几个星期的时间内只反应原产率的几个百分点。在化合物2中加入比半胱氨酸更好的亲核试剂的2-（2-（2-（2-（2-巯基乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙醇（MEEEE）在室温下须放置不少于1天。因此，具体的反应条件和硫醇性质对偶联反应的速度具有较大的影响。确实，尽管用2加扰的硫醇显著快于其它可逆的偶联物加入，但是一些化学家可能不会定义需要几小时至几天并且稍微少于一定量反应，作为是点击反应。我们介绍的变换可能不够。然而，在其他情况下，我们认为独特的偶联选择性和解点击性使得这种新的转化有广泛的用途。

在我们的早期研究中，通常在巯基被加入到没有任何中间纯化的化合物1中之前，首先引入胺进行反应。然而，我们还发现胺和硫醇可以同时加入，生成相同的产物，因为2的选择性和与硫醇加成的可逆性。在这方面上，我们测试了苯硫酚，辛硫醇和NAC作为硫醇与苄胺，炔丙胺和1-氨基-3-丁炔的多种成对比较它们的反应，显然可以加入两倍的胺到化合物1中，但最终将恢复原状，即化合物3（补充资料第5部分）。

如上所述，化合物1不仅可以连接胺和硫醇，而且该链接能以化学方式可逆地完全再生为原来的胺和硫醇。如图1所示，我们发现DTT能与3反应。它释放出硫醇和胺并产生加合物5并通过1 H-NMR和13 C-NMR光谱（见补充资料）确认5的结构。然而，有趣的是，beta;-巯基乙醇（BME）（结构本质上是DTT的一半）不进行相同的反应，而是简单地加入巯基可逆地释放原来的硫醇而不释放原来的胺。 因此，我们假设七元环与DTT的第二硫醇首先形成，因为其具有高于两种DTT醇的良好的内部分子亲和力和更好的亲核性。

图2 ：结合受体1可用于制备有许多分支的组合体。 1,3,5-三氨基甲基苯首先与1反应形成6再加入NAC，用N 2不断鼓泡形成7。接着，加入MPA进一步搅拌这些硫醇，得到平衡混合物7， 8，9和10。

图3：结合受体1可用硫醇可逆地官能化它的表面。 使TentaGel SBr树脂与1,3,5-三氨基甲基苯（11）反应，然后用1使12的表面上的结合受体固定化。接着，向12中加多种硫醇（见插图），并使其平衡三天。最后，在彻底洗涤除去未结合的物质之后，用DTT处理树脂以除去连接的硫醇，并对该反应溶液进行LC-MS法分析检测。

然后该环快速重排为具有更强热力学上有利的五元环，其具有乙烯基酯。这类似于肽的天然化学连接42,43。为了测试这一假说并且发现可能类似于DTT起作用的其他1,2-和1,3-二核苷酸，我们筛选了几种潜在的解偶联剂：乙二硫醇（EDT），丙二硫醇（PDT），半胱氨酸，半胱胺，巯基乙酸 TGA）和乙二胺（EDA）。相对于DTT，EDT和半胱氨酸更有效地除去了胺和巯基。 PDT和半胱胺也用作去偶联剂，尽管反应比其它反应进行得更慢。与BME一样，TGA从3中释放出硫醇; 然而，其没有环化和释放胺。我们假设，BME和TGA的醇和羧酸酯都不具有足够的亲核性取代胺。最后，EDA不释放任何胺或可检测量的硫醇。

如所预期的，DTT反应的温度从室温增加到45℃使脱盐的速度从1天左右缩减到几小时（补充资料第7部分）。DTT是一种固体，它的气味小于液态和气态硫醇，并且相对便宜，这使得它是迄今为止最有效的解偶联剂。然而，当不需要还原剂时，半胱氨酸也可以是有效的去偶联剂。总体而言，从3中清除胺和硫醇的能力有助于该试剂在多个化学子领域的各种应用中的潜在效用。 我们在这里详细列举几个例子。

结合受体1可用在处于超分子化学环境中的水溶液中构建和解离含有胺和硫醇的组分的组合体。这样的方法在动力学组合的化学工具包中特别有用29,30,44，因为它能可逆地加入硫醇并可以针对客体以形成不同的受体的模板。作为如何1可以用于形成组件的实例，我们将其与1,3,5-三氨基甲基苯偶联以形成6（见图2），然后加入NAC合成了7。将未反应的6和链接加合一个、两个、三个NAC的6的混合物连续鼓泡以使得反应驱向至7进行。接着，将3-巯基-丙酸（MPA）加入到反应中，得到动力学上交换的由NAC和MPA（即8和其他的化合物）形成的产品。最后，使反应平衡6天，而不是像其它缀合物需要几周合成28,29,33-36，再添加DTT，这使得所有硫醇和原来的三胺支架的完全再生（补充资料第8a-8c部分）。

我们进一步探索了1作为动力学上的固定剂能用在固体支持物上产生的硫醇R基团的多价呈递的用途45,46。为此，我们将1,3,5-三氨基甲基苯与TentaGel SBr树脂反应，使三个胺基之一固定该支架（见图3）47。接着，将1加入到树脂中使结合受体安装到剩余的两种游离的胺基上。向该官能化树脂中加入五个硫醇的小文库（见图3），以在TentaGel树脂的珠子上产生二价单元的混合物，使该反应平衡三天。MM可以通过洗涤而不是鼓泡除去。平衡后，彻底洗涤树脂以除去任何未结合的物质，直到洗涤液不能检测到硫醇含量。随后，用DTT处理树脂以除去结合的硫醇。使用液相色谱—质谱（LC-MS）检验该反应的洗涤液中的五种硫醇和化合物5的存在。所有硫醇以原始的形式和原来大致相等的比例存在。因此，我们发现1可用于官能化固相中的分子，它能用硫醇标记，再借助DTT脱落（补充资料第8d-8g部分）。

图4 ： 结合受体1能用小分子和其它肽可逆地官能化肽。 通过固相肽方法合成肽IAHRFKDLGE并与1（左）反应。 随后将所得肽与MEEEE偶联，并与6聚体肽（VVKLKC，右）单独偶联。 交联的肽用DTT处理，它能再生IAHRFKDLGE，MEEEE和VVKLKC。

因为1在中性pH的水溶液中起作用，所以该试剂能应用于能与氨基和巯基生物偶联的肽和蛋白质。作一个原理证明，我们首先用1将含有赖氨酸的十肽的ε-胺偶联到小体积硫醇（MEEEE）和含半胱氨酸的6-聚合体肽上（见图4）。随后用DTT处理所得产物，分别再生游离十肽和MEEEE和6聚体（补充资料第9部分）。在我们的一些其他的没有包括在本文的研究中，我们发现醇侧链的存在不影响胺和硫醇的加合到1。

图5 ：结合受体1能在巯基封端的PEG链上可逆地官能化蛋白质。 a：来自肌红蛋白所消化的葡萄糖的1-MEEEE修饰的WQQVLNVWGKVE（2 ）的碰撞诱导解离质谱。 b，强调肌红蛋白的序列以显示了使用SEQUEST确认并指定的1修饰的所有位点。 粗体和下划线的位置是发生1和MEEEE加合的位置。粗体和斜体的位点只能观察到1所修饰的位置。

为了延长作为可以逆转的生物学上有用的缀合剂的效用，我们允许1与马肌球蛋白中的赖氨酸反应，然后将功能化的肌红蛋白与MEEEE连接，MEEEE实现了该聚乙二醇（PEG）链与至少五个赖氨酸（K17，K46，K57，K134和K148）。在这种情况下，胺的添加需要一整夜

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