现代固相多肽合成的方法和策略外文翻译资料

 2022-12-10 15:58:35

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现代固相多肽合成的方法和策略

Muriel Amblard,* Jean-Alain Fehrentz, Jean Martinez, and Gilles Subra

摘要：这篇文章的目的是划定的战略考虑，并提供实际的程序，使非专家能够合成肽与一个合理的机会，成功。这篇文章是不是百科全书，而是致力于固相多肽合成的FMOC / TBU（SPPS）方法，这是目前多肽生产中最常用的方法。介绍了SPPS与连接器的审查和支持当前采用的原则。因为SPPS如锚，不同步骤的基本概念脱保护、反应和解理耦合进行了讨论随着聚合副反应的可能的问题。为充分保护多肽合成必不可少的方法提出了包括树脂处理、偶联、封盖，最终裂解和Fmoc保护，二硫键的形成。

关键词：固相多肽合成（SPPS）；树脂；Fmoc SPPS；偶联剂；保护基；锚固；副反应。

1.介绍

目前，“多肽合成”包括从小肽到大蛋白质等各种材料的制备的大范围的技术和程序。布鲁斯Merrifield的开创性工作（1）介绍了固相多肽合成（SPPS），极大地改变了多肽合成的方法，简化了繁琐和苛刻的纯化液相合成的相关步骤。此外，Merrifield的SPPS现在也允许自动化的发展和广泛的机械仪表使用。在定义了一个多肽的氨基酸序列的合成策略和编程，机器可以自动执行所有的合成步骤所需的准备多个多肽样品。SPPS已成为合成多肽首选的方法，虽然液相合成还是可以用作一个给定的肽的大规模生产。

2.材料

1.反应容器(见Fig.1)

2. 聚四氟乙烯（PTFE）棒（15厘米长、0.6–直径0.8厘米）。

3.转子

4.过滤瓶。

5.多孔玻璃。

6.冻干机。

7.高效液相色谱法（高效液相色谱）的反向相碳18柱。

8.指示纸。

9.溶剂N，N-二甲基甲酰胺（DMF ] [， [ ]甲醇甲醇，二氯甲烷[DCM]）洗瓶子。

10.二isopropylethylamide（DIPEA）。

11.在DMF溶液（20:80）哌啶。

12.凯撒测试解决方案（茚三酮、吡啶、苯酚）（注1）。

13.Fmoc氨基酸侧链与保护（表1）。

14.三氟乙酸（TFA）。

15.三isopropylsilane（TIS）。

16.甲基叔丁基醚（MTBE）。

3.方法

3.1.SPPS的原则

由于肽的合成涉及到许多重复的步骤，使用固相载体具有明显的优势。有了这样一个系统，大量过量的试剂在高浓度下可以驱动耦合反应完成。过量的试剂和副产品可以从不断增长和简单的过滤和洗涤中实现不溶性肽的分离，并且所有的合成步骤可在同一容器中进行而没有任何材料转移。

SPPS的原理如图2所示。C-末端氨基酸残基的N-保护基通过其羧基羟基（或氯）或氨基树脂产量分别为酯或酰胺连接肽，将最终产生一个羧基酸或C端酰胺肽。在加载第一个氨基酸所需的肽序列组装在一个线性的方式从C端到N端（C到N策略）的N脱氨基酸偶联反应的重复周期。

氨基酸的侧链官能团必须被屏蔽，在反应条件下使用的永久保护基团是稳定的。由临时保护基团（通常是氨基甲酸酯衍生物）保护的氨基基团。临时保护组（T）可以温和的条件下保持完整性和降低肽异构化率下容易去除，这可以通过5（4H）-连接时的步骤的活化氨基酸恶唑酮组（2,3）如图3所示。氨基甲酸酯对异构化的保护作用也解释了C到N策略的优势。

耦合后，反应物经过滤洗涤除去多余的。临时的N-末端保护组被允许下n-urethane-protected氨基酸残基通过其alpha;活化羧酸。这个过程（脱/耦合）被重复，直到获得期望的序列。在最后一步中，肽从树脂和侧链保护基团释放（PN）伴随删除。

3.2. Fmoc/tBu SPPS

结构中，使用了两种主要策略：Boc/Bzl和Fmoc/tBu成为T / PN保护基团的方法。前者的策略是基于侧链保护组的完全酸不稳定性。在这种方法中，Boc保护基团是由整齐的三氟乙酸（TFA）去除或二氯甲烷中的TFA并且侧链保护组和肽–树脂联系在合成结束用强酸如无水氢氟酸（HF）除去。虽然这种方法使得大的多肽和小蛋白得到高效合成，但是使用剧毒的HF和需要特殊的聚四氟乙烯内置设备限制了这种方法，因为只适用于专家。此外，使用强酸性条件下，对含有脆性序列的肽的结构的完整性可以产生有害的变化。

Fmoc / TBU（4）方法是基于正交保护组策略。这种方法使用的基础–活性N-Fmoc基团的alpha;保护氨基功能，酸–活性侧链保护组和酸–活性连接构成的C-末端氨基酸保护基。这一策略的优点是暂时的和永久的正交保护是通过不同的机制允许温和酸性条件下的肽从树脂裂解，最后脱保护和裂解。出于所有这些原因，基于SPPS Fmoc方法是现在的常规合成肽方法的选择。

图2.SPPS的合成原理

3.3.固相支持

基体聚合物和连接器可以表征固相载体（5）。通常情况下，“树脂”被不恰当地使用在连接系统的地方，由于忽略了一个事实，即基体聚合物，在支持化学作为溶液相（6）是重要的。由于大量不同的树脂上是市售的，他们中的一些带着同样的连接器，应特别注意选择最合适的交联剂的合成。

3.3.1.基质聚合物

交联聚苯乙烯（PS）树脂是常规SPPS里最常用的。对于在溶剂如DMF和DCM的聚合物的溶胀中，200 - 400目粒径分布珠（相当于一个直径约50mu;m）和能加载0.5至0.8毫摩尔/克等展现了好的特性，反应物的扩散到聚合物基质中，并连接部位埋入珠。对于较大的肽（超过25个氨基酸）或更困难的序列，较低的负载需要（0.1 - 0.2毫摩尔/克）。

以交联聚酰胺基树脂和复合聚苯乙烯聚乙二醇（聚乙二醇）为基础的树脂，比聚苯乙烯树脂的亲水性更强。它们在微观和宏观的水平（7）表现出不同的物理性质。这些载体，往往具有较低的负载能力，可能代表一种替代标准的交联聚苯乙烯树脂的合成困难的序列和大的肽。

3.4.树脂的处理

3.4.1.SPPS的反应容器

SPPS可以在经典玻璃反应容器完成，器皿可由公司或购买厂家进行（图1）。另外，注射器装有聚四氟乙烯或玻璃也可以使用。

反应容器的尺寸应与所用树脂的用量有关，根据表2。

3.4.2.溶剂

作为耦合点99%不在表面而在树脂里，珠子承载着越来越大的肽链溶胀是必不可少的操作，使最佳渗透活性保护氨基酸在聚合物基体中，从而提高耦合率。在开始固相合成前，树脂在适当的溶剂如DCM和DMF为20到30分钟溶胀（方法1）。对在SPPS中用的交联聚苯乙烯珠，用DCM进行最优的溶胀性能。在连接步骤，非极性溶剂如DMF、NMP优先提高反应物的溶解度。对聚苯乙烯树脂（见注2）醇类和水是不足以溶胀的溶剂。然而，甲醇或异丙醇可在洗涤过程中使用（方法2）缩小PS树脂。这个收缩将有效地去除反应物的过量。经过这样的处理，PS珠子应该在DCM和DMF中溶胀。

3.4.3.搅拌混合

这是没有必要的大力搅拌反应釜，由于在SPPS中扩散现象决定于反应动力学。此外，大多数类型的树脂用于多肽合成是易碎的，所以不建议磁力搅拌。一个古老的旋转蒸发器转子可用于搅拌耦合和脱保护步骤或者任何装置的摇摆或涡流使光滑搅拌时是合适的。由于珠通常贴在玻璃，因此重要的条件是，所有表面的反应器中必须接触的反应混合物在搅拌。

3.4.4.洗涤

洗涤步骤是在耦合和脱保护步骤去除可溶性的副产品和过量的反应物必要的操作。用溶剂填充在一个洗涤瓶内的反应器，在真空下将其排空，是一种合适而简单的方法。如果需要，可以用聚四氟乙烯棒进行洗涤溶剂中树脂的搅拌和搅拌。

Fig. 4. Resins for peptide amide synthesis.

方法1：树脂溶胀

1.将干树脂在适当的反应容器（见3.4.1子目。）。

2.填充器DCM直到所有树脂沉浸。树脂悬浮液可轻轻混合用聚四氟乙烯棒。

3.离开30到20分钟。

4.去除DCM过滤真空。

方法2：标准洗涤程序

1.填充反应容器DMF。

2.离开10秒，并通过过滤除去溶剂。

3.认真清洗螺丝帽和DMF反应器的边缘。

4.用DMF重复步骤1和2两次。

5.重复步骤1和2的甲醇。

6.用DCM重复步骤1和2。

7.用DMF重复步骤1和2。

3.5.Fmoc为基础的SPPS的连接器和树脂

SPPS的第一步负载的N-末端氨基酸残基的固体支持通过酯或酰胺键取决于目标肽的C-末端官能团（分别为酸或胺）。大多数的公司是市售的加载在不同基质（PS、PA、PEG-PS）。珠（球）用以下段落符号是通用的，并不是指一个特定的矩阵。

3.5.1.肽键

对于C端肽键的合成，常用的树脂是1到3（图4）（8–10）。这些树脂和Fmoc化学和最终的TFA裂解兼容。对于第一个聚氨酯保护渣附着，标准肽耦合程序（方法5）可以使用。这些树脂通常是提供Fmoc保护应保护相关基团。对于笨重的C-末端氨基酸，一个双联的步骤可以是必要的。

3.5.2.肽酸

通过酯化反应使锚氨基酸耦合到固相上，往往是更难的，甚至是危险的，对于一些残留会导致差向异构化，二肽的形成和低取代。因此，我们建议树脂预装第一末端N-保护氨基酸通过向市售的厂家购买获得。

在FMOC / TBU的C-末端肽酸的合成策略，在图5报道常用的树脂（11–14）。在使用前必须在无水介质和含有水的氨基酸中进行加载反应。

3.5.3.羟甲基树脂

对羟甲基树脂4到6的酯键形成顺畅的树脂如王树脂4具有甲氧基树脂5和6提取比较容易。最常用的酯化法是对称酸酐法（3）。装载的测定可采用Fmoc释放进行测量（见注3）。在难以加载的情况下，酯化步骤可以重复使用新鲜的反应物。精氨酸衍生物可以需要三个酯化步骤来实现正确的负载。锚固后，未反应的树脂结合的羟基上限应该由苯甲酸酐或乙酸酐（见方法3、8步）。

方法3：羟甲基树脂

1.将树脂在适当的表面反应。

2.树脂在方法1中所描述的膨胀。

3.所需的Fmoc氨基酸（10当量相对于树脂替代）被放置在一个干燥，用磁力搅拌器的圆底烧瓶和溶解在干燥的DCM在0°C（3毫升/毫摩尔）。干DMF一些下降可能是达到完全溶解有用。

4.添加DIC（5当量），搅拌10分钟，在0°C.如果观察到沉淀，加入DMF溶解和搅拌直到10分钟以上。

5.将解决方案添加到羟甲基树脂。

6.溶于二甲氨基吡啶（DMAP）（0.1–1当量）在DMF和解决方案添加到反应混合物。

7.1小时后搅拌，DMF洗树脂（三次），最后用DCM。

8.真空干燥18 h的树脂上进行样品测量Fmoc释放之前（见注3）。当负载小于70%时，重复酯化步骤。

9.当所需的替代实现，通过添加苯甲酸或乙酸酐帽剩余的羟基（5式）和吡啶（1式）在DMF中的树脂（以前溶胀）搅拌30分钟。

10.洗树脂（方法2）和经典的延伸与保护的氨基酸开始后Fmoc保护（方案7）。

3.5.4.三苯甲基树脂

三苯甲基树脂是不稳定酸。链接器的空间位阻，防止二酮哌嗪形成和这些树脂推荐脯氨酸和甘氨酸羧基端肽用。非常温和的酸解条件使树脂从保护肽段裂解。这些树脂是市售的，因为它们的氯化物或醇的前体。三苯氯树脂极为水分敏感，所以试剂和玻璃器皿使用前应避免水解成醇形式认真干。需要激活的三苯甲醇的前体，它是高度推荐激活氯之前使用（见注4）。激活后，首先发生的残留附着Fmoc氨基酸衍生物在碱的存在下反应。这种反应并不涉及活性物种，所以它是无差向异构化。应采取特殊的预防措施半胱氨酸和组氨酸残基，在激活过程中异构化特别敏感（表2）。

方法4：三苯甲基树脂

1.将1克的三苯型树脂（1–2 mmol氯化／g树脂）在SPPS的反应容器。

2.在方法1中所描述的树脂膨胀。

3.添加一个Fmoc氨基酸和7.5当量的干DCM DIPEA 3当量溶液（10毫升/克树脂）。

4.在室温下搅拌30至60分钟的混合物。

5.DMF洗树脂（两到三次）。

6.添加一个DCM /甲醇/ DIPEA混合10毫升（80:15:5）限制任何剩余的活性氯组。

7.混合15分钟和过滤器。

8.洗树脂三次DMF和DCM。真空干燥后，替代可以从Fmoc释放（见注3）。

3.6.侧链保护组

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