多靶点血管生成抑制剂伊曲康唑白蛋白胶束纳米粒对非小细胞肺癌的肿瘤进展的影响外文翻译资料

 2022-12-28 15:39:49

多靶点血管生成抑制剂伊曲康唑白蛋白胶束纳米粒对非小细胞肺癌的肿瘤进展的影响

原文作者：Ling Zhang, Zhengsheng Liu, Kuan Yang, Chao Kong, Chun Liu, Huijun Chen, Jinfeng Huang and Feng Qian

摘要：伊曲康唑（ITA）是一种较古老且广泛使用的抗真菌药物，具有良好的安全性，最近被证明是一种影响多种血管生成刺激信号和途径的多靶点抗血管生成剂，这些刺激信号和途径包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）糖基化和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）。在本研究中，我们开发了两种纳米粒子配方，即聚合物胶束（IP2K）和白蛋白纳米粒（IBSA），以溶解极疏水和不溶性ITA，以便静脉给药和作药代动力学（PK）/药效学（PD）比较。虽然没有一种药物在体外对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞表现出较强的抗增殖作用，但当以与NSCLC患者衍生的异种移植（PDX）模型等效的ITA剂量给药时，IBSA延缓了肿瘤的生长，而IP2K则加速了肿瘤的生长。我们将这种矛盾现象的原因归结于药物依赖性PK和对血管的操作：IBSA表现出更持久的PK值，其最大C值为IP2K的60-70%，AUC是IP2K的2倍，可能通过血管正常化来减轻肿瘤缺氧。相反，IP2K的高C-max通过强烈的血管生成抑制作用，使肿瘤缺氧，加重肿瘤的侵袭性，加速肿瘤的生长。此外，与IP2K相比，IBSA诱导的肝脏和血液毒性最小，并能显著增强紫杉醇白蛋白纳米粒的体内肿瘤抑制活性。这些发现表明，处方和药代动力学是设计ITA血管生成疗法时需要考虑的关键因素，IBSA可作为一种新的、安全的、与其他抗癌药物联合应用的多靶点血管生成治疗方法。

关键词：伊曲康唑；血管生成；纳米粒制剂；药代动力学；非小细胞肺癌

1、引言

肿瘤的生长和转移离不开血管生成。在过去的十年中，以贝伐单抗（Avastin）为代表的抗血管生成疗法已经在临床上得到了广泛的应用，贝伐单抗是一种人源化的抗血管内皮生长因子（antiVEGF）的单克隆抗体，最初被美国FDA批准可与细胞毒性剂联合用于抗结肠直肠癌、转移性非小细胞肺癌（NSCLC）、转移性乳腺癌等。虽然贝伐单抗显示出了一些临床上的益处，但也存在着严重和异常的毒性，包括胃肠穿孔、伤口愈合并发症、动脉血栓栓塞并发症、严重咯血和出血等。此外，贝伐单抗也给许多患者带来了沉重的经济负担。

伊曲康唑（ITA）是一种被广泛使用的三唑类抗真菌药，具有广谱抗菌活性和良好的耐受性，通过抑制真菌的羊毛甾醇14alpha;-去甲基酶（细胞色素P450）干扰真菌细胞膜中甾醇的生物合成，致使真菌细胞死亡。有趣的是，在过去十年的药物再利用研究中，发现了ITA的新生物学机制，包括有效的抗血管生成活性。ITA被发现能够影响多种血管生成刺激途径，抑制血管内皮生长因子受体-2 （VEGFR2）糖基化、血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）介导的血管生成刺激，并调节内皮细胞中雷帕霉素（mTOR）信号轴的哺乳动物靶点。因此， ITA有可能发展成为一种新型、安全、经济的抗血管生成剂，因为其抑制了多种下游信号通路，且不易产生耐药性。

ITA可导致血管内皮生长因子和纤维母细胞生长因子介导的内皮细胞迁移和内皮管形成的剂量依赖性抑制。因此，精确递送ITA以实现理想的药代动力学效果对于实现其体内抗血管生成作用至关重要，因为血管生成抑制剂可以抑制肿瘤生长，但当以不同的方式递送时，它们也可能起到增加肿瘤生长的相反效果，尽管这一概念的证明仍然很少。ITA是一种溶解性非常差的弱碱性药物，在胃中酸性pH条件下，其在水中的溶解度在~ng/mL和~1mu;g/mL数量级之间。在pH和食物的影响下，无定形口服ITA胶囊制剂显示出较低和可变的生物利用度，而每10毫克ITA被400毫克羟丙基-beta;环糊精溶解的静脉注射制剂（斯皮仁诺注射液）显示出较严重的肾毒性。作为一种新的血管生成抑制剂，ITA进一步的临床评价离不开安全、精确地给药，以及建立药代动力学/药效学（PK/PD）关系。

在本研究中，我们开发了两种用于静脉注射的ITA纳米颗粒制剂，即一种基于聚乙二醇-聚（D，L-乳酸）（聚乙二醇-聚乳酸）胶束（IP2K），另一种基于白蛋白络合（IBSA），并在体外（抗非小细胞肺癌细胞增殖）和体内 （大鼠全身药代动力学，以及对患者来源的非小细胞肺癌异种移植模型的肿瘤抑制）进行了比较。因为许多血管生成机制已被证明在非小细胞肺癌中起重要作用，我们比较了非小细胞肺癌中的ITA制剂。有趣的是，尽管没有一种制剂在体外对非小细胞肺癌细胞显示出明显的抗增殖作用，但当非小细胞肺癌患者衍生的异种移植物（PDX）小鼠用不同的制剂治疗时，却观察到了相反的肿瘤生长趋势，这归因于ITA治疗时所需的良好的PK/PD平衡。

2.材料和方法

2.1 胶束（IP2K）和白蛋白（IBSA）基制剂的制备。

ITA购自中国北京瓯河化工有限公司。聚乙二醇聚乳酸嵌段共聚物（PEG2KPLA2K，分子量= 4 kDa）从戴刚生物技术有限公司（中国济南）获得。牛血清白蛋白（BSA，白蛋白牛V）购自Amresco（美国）。所有有机溶剂都是分析级的。

采用薄膜水合法制备了聚乙二醇-聚乳酸胶束制剂。简而言之，将300毫克聚乙二醇单丁醚和40毫克吲哚乙酸溶解在乙腈中。用旋转蒸发器在60℃蒸发有机溶剂，形成透明薄膜。然后在60℃用10毫升生理盐水将薄膜水合，并超声处理1分钟，得到4mg/ml的均匀乳状胶体溶液。对于体内给药，由于冻干ITA胶束溶液的稳定性是众所周知的，所以将获得的胶束制剂稀释至2mg/ml，通过0.22微米注射器过滤器过滤，并立即使用，无需冻干。经高效液相色谱证实，过滤后的胶束制剂的浓度保持不变。

白蛋白纳米颗粒制剂（IBSA）的制备与报道的纳米颗粒白蛋白结合技术相似。简而言之，将400毫克ITA溶于4毫升含1%乙醇的氯仿中，将3600毫克牛血清白蛋白溶于100毫升水中。然后将两种溶液相互混合，并在1300 bar下均质化10个循环。用旋转蒸发器在30℃下将溶液中的有机溶剂除去30分钟，然后将剩余的溶液冻干。使用前，通过在生理盐水中轻微摇动，将获得的冻干物重新配制成ITA浓度为4mg/ml的溶液。类似地，将获得的白蛋白制剂稀释至2mg/ml，并通过0.22微米注射器过滤器过滤，通过高效液相色谱法确认过滤制剂的浓度保持不变。紫杉醇（PTX）白蛋白纳米粒制剂（PBSA）按IBSA的方法制备。

2.2 IP2K和IBSA的透射电镜分析。

用磷钨酸负染色的透射电镜研究了IP2K和IBSA的形貌。

2.3 IP2K和IBSA对A549非小细胞肺癌细胞增殖的影响。

使用从ATCC获得的A549非小细胞肺癌细胞进行增殖试验以比较体外IP2K和IBSA。细胞在DMEM中生长，用10%胎牛血清（FBS）补充100单位/毫升青霉素和100mg/ml链霉素，并在37℃下、5% CO2/95%空气的加湿培养箱中培养，没有支原体感染。对于通过MTS试验进行的增殖研究（CellTiter 96，Promega），将细胞以1500细胞/孔接种到96孔板中，并在第二天用IP2K或IBSA处理。在处理后18、26、38、49、63和86小时，记录用不同ITA浓度（0、0.25、1、2、4、8、16、32mu;M）处理的细胞。数据表示为平均值plusmn;标准误值相对增加，并用曲线图表示为每次处理6个孔的处理/对照值。

2.4 IP2K和IBSA在大鼠体内的药代动力学比较。

在大鼠体内进行IP2K和IBSA的系统药代动力学比较。SD大鼠（雄性，220-300克，6-8周龄）购自中国维通利华（北京维通利华实验动物技术有限公司）。通过外科手术将留置颈静脉套管植入大鼠中，并单独安置在悬浮笼中，自由提供啮齿动物饲料和水。按每个给药组三只小鼠进行单剂量静脉注射，在给药后5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、7小时、9小时、24小时和48小时收集0.3毫升外周血样品。将获得的血液收集在含有乙二胺四乙酸钠的试管中，并以2000克离心10分钟以收集血浆。以含罗红霉素（ROX）的乙腈/甲醇（1/1，v/v）为内标物，用蛋白质沉淀法从100 mu;L血浆样品中提取出ITA及其代谢产物羟基伊曲康唑。然后在室温、温和的氮气流下将有机层蒸发至干（CentriVap浓缩器，美国）。ITA和OHITA的再溶解浓度使用快速分辨率液相色谱系统（日本岛津Nexera UHPLC LC-30A）进行定量检测，并在AB SCIEX三重四重4500（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上使用电喷雾电离源（涡轮离子喷雾）进行检测。ITA和OH-ITA的标准曲线范围分别为5～500ng/ml和1～500ng/ml。

接下来评估了ITA和OH-ITA的下列药代动力学参数:药物在血浆中的最大浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）、清除率（CL）、平均滞留时间（MRT）、给药后0至48小时血浆浓度-时间曲线下的面积（AUC 0-48小时）。AUC通过梯形求和计算。所有药代动力学数据在分析前均经过LN转换。双侧、不对称的t检验被用于检验显著性差异水平。

2.5 IP2K和IBSA在患者来源的非小细胞肺癌异种移植（PDX）模型中的体内抗肿瘤比较。

通过腺体构建手术收集原发性患者的固体组织。通过基因测序（北京瑞生物技术有限公司）对组织进行Kras外显子2、Kras外显子3和外显子20突变的鉴定。引物对列于表1。然后，将患者组织切成小块（约2 mm3）并植入NOD/SCID/IL2lambda;-受体（NSG，清华大学实验动物研究中心培育）小鼠皮下作为第0代（P0）。随后的传代（P1和P2）与P0相似，其中来自早期传代的肿瘤组织被处理并直接再植入一大群NSG雄性小鼠中。将P3肿瘤组织匀浆处理成单细胞悬液，将～1times;106细胞（50% PBS和50% Matrigel）皮下植入BALB/c nu/nu小鼠（北京生命河实验动物技术有限公司）腹股沟区。当肿瘤大小达到60～100 mm3时，将小鼠随机分为不同的治疗组，并通过尾静脉注射给予IP2K、IBSA、PBSA和IBSA/PBSA混合物，剂量为ITA或PTX 15 mg/kg（每6天一次，times;4）。肿瘤大小（V）使用以下等式随时间而定:V = L times;W2/2，其中L和W分别是用卡尺测量的肿瘤的长度和宽度。

表1：引物信息

2.6 IP2K或IBSA治疗后PDX肿瘤的组织学和免疫组织化学。肿瘤组织在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后转移到70%乙醇中。将组织包埋在石蜡中，通过CD31（武汉赛维尔生物科技有限公司，GB12063）、血管内皮生长因子（武汉赛维尔生物科技有限公司，GB11034）、胱天蛋白酶-3（武汉赛维尔生物科技有限公司，GB11009）和Ki-67（武汉赛维尔生物科技有限公司，GB13030-2）染色的标准方案对4个微米切片进行免疫组织化学（IHC）处理。图像是在光学显微镜（蔡司成像仪，A2m，德国）上拍摄的。使用Image-Pro Plus 6.0对每个肿瘤进行阳性细胞鉴定和评分。

2.7 收集的PDX肿瘤的免疫印迹分析。通过用RIPA缓冲液匀浆获得第44天收获的肿瘤的总蛋白。通过标准方案对HIF-1alpha; （Boster，BA0912）和beta;-肌动蛋白（武汉Servicebio technology，GB13001-1）进行蛋白质印迹检测。

2.8 血细胞计数和生物化学。在PDX动物被处死之前，在眼眶末稍出血处进行全血细胞计数，并使用BC3000Plus自动血液分析仪（中国明得利有限公司）进行分析。血清由HITACH17080自动化学分析仪（日本日立有限公司）分析。

3、结果与讨论

3.1. 聚合物（IP2K）和白蛋白基（IBSA） ITA纳米粒子的表征。ITA（图1A）是一种水溶性极差的分子（在水中为1ng/ml），具有较高的亲脂性（logP 5.66）和较强的白蛋白结合力（99.8%）。因此，我们开发了聚乙二醇-聚乳酸胶束和白蛋白纳米粒，将ITA封装到纳米悬浮液中，以增加其表观溶解度，从而能够静脉给药，并改变ITA的药代动力学特征。体外和体内的比较将分别采用4、2mg/ml的制剂。这两种纳米颗粒技术都有长期安全临床应用的历史，并且与相对常规的溶液制剂相比，具有较成熟的改善各种抗癌药物的药代动力学特征并提供治疗益处的能力。

图1：（A） ITA和PEG-PLA的化学结构和牛血清白蛋白的卡通结构。（B、C）聚乙二醇-聚乳酸基ITA纳米悬浮液（IP2K）和白蛋白基ITA纳米粒子（IBSA）在溶液中的外观和透射电镜照片，均为4mg/ml和2mg/ml。

IP2K和IBSA纳米粒子均具有10%的ITA负载量，并且在水溶液

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