GATA3控制小鼠耳蜗感觉区域和神经元存活的规范外文翻译资料

 2023-01-04 10:20:16

GATA3控制小鼠耳蜗感觉区域和神经元存活的规范

HDR综合征(又称Barakat综合征)是一种以甲状旁腺功能减退为特征的发育障碍，感觉神经性耳聋和肾脏疾病。虽然遗传图谱和随后的功能研究显示GATA3单倍型不足可引起人类HDR综合征，GATA3在感觉神经性疾病中的作用，耳聋和听觉系统的发展在很大程度上是未知的。在本研究中，我们发现GATA3是连续的，在发育中的小鼠内耳中表达。发育中内耳GATA3的条件敲除，小鼠内耳的形态发生变化，导致耳蜗管紊乱和缩短，毛细胞和支持细胞明显减少，GATA3功能的丧失导致规范的失效，在耳蜗管中增加细胞死亡。而且，虽然 GATA3缺失对小鼠耳蜗前庭神经节(CVG)细胞的生成不受影响，螺旋神经节神经元(SGN)由于细胞凋亡而几乎耗尽。我们的结果表明GATA3在指定耳蜗前感觉结构域和调节SGN存活方面起着重要作用，从而确定了人类HDR综合征的分子机制。

引言

在哺乳动物中，声音和平衡感受由内耳介导，内耳是由耳蜗和前庭系统组成的复杂结构。 耳蜗的核心听觉成分是含有感觉毛细胞和支持细胞的Corti器官。哺乳动物耳蜗毛细胞有两种解剖学和功能上不同的类型：外毛细胞和内毛细胞（OHCs和IHCs）。IHCs检测耳蜗流体中的声波，并将它们转换成电信号，然后通过听觉神经（螺旋神经节）传递到听觉脑干和听觉皮层，而OHCs被认为是调制声波通过与耳蜗分区的机制相互作用。 在发育过程中，高度专业化和复杂的内耳结构是通过精的基因控制产生的。

已经确定了许多调节内耳发育的基因1。 在这些基因中，转录因子包括Atoh1（编码碱性螺旋 - 环 - 螺旋家族转录因子）2，Sox2（编码Sry相关HMG盒转录因子）3，Pax2（编码配对盒子同源转录因子）4和Pou4f3（编码POU-同源域转录因子）5—6受到特别关注，因为这些基因的靶向诱变在内耳的感觉器官中引起严重的发育缺陷。例如：指定Corti3器官的感觉前体，而Atoh1是前体分化成毛细胞不可或缺的2-7。类似地，转录因子在内耳神经元的发育中起关键作用。 基本的螺旋-环-螺旋家族转录因子NEUROD是耳蜗前庭神经节（CVG）的最早标记之一，NeuroD导致分层后CVG中神经元的快速损失，导致小鼠胚胎日（E）13.5处几乎所有神经元的损失7-8。相反，体外内耳外植体培养中NeuroD的异位表达足以将非感觉细胞转化为神经元细胞9。 这些结果表明转录因子在内耳发育中的关键作用。

进化上保守的GATA家族转录因子的特征在于它们通过它们的保守锌指DNA结合结构域与共有DNA序列5 - （A / T）GATA（A / G）-3结合的能力10）。已经在脊椎动物中鉴定了六种GATA因子（GATA1-6）并且在不同的组织中表达10。 其中，GATA3在听力中起关键作用，因为GATA3的单倍体不足导致人类HDR综合征11），一种以甲状旁腺功能减退症（H），感音神经性耳聋（D）和肾病（R）为特征的发育性疾病12）。 在发育中的肾中，GATA3对于肾管的形态发生和引导是必需的13。 最近，Grigorieva等人14发现由于甲状旁腺特异性转录因子GCM2的失调，GATA3缺陷型小鼠会发生甲状旁腺异常。 尽管这些研究揭示了GATA3基因在副甲状腺和肾脏（受HDR综合征影响的两个器官）的发育和功能中的作用，但不知道GATA3如何调节听觉系统的发育和功能。

以前的研究表明，GATA3在内耳和听觉神经元中表达15，并且GATA3的靶向诱变影响耳朵的早期形态发生16。GATA3无效突变导致E12周围的早期胚胎致死性17，只有有限的内耳形态发生的阶段。部分由L-苯肾上腺素部分拯救的GATA3缺陷型胚胎在感觉器官形态发生中仍然存在缺陷。 在药物拯救的胚胎中，前庭感觉上皮细胞成功产生有限数量的毛细胞，而在耳蜗感觉上皮细胞中没有检测到感觉分化的证据27。在此，为阐明GATA3在内耳感觉器官和神经元发育以及耳聋疾病中的确切作用，我们创建了GATA3的小鼠条件敲除等位基因，并使用Pax2-Cre小鼠在发育中的耳中特异性删除GATA3。 我们发现有条件的GATA3敲除导致严重的内耳缺陷。 与正常对照相比，由于细胞凋亡增加以及毛细胞和支持细胞的发生非常有限，GATA3无效小鼠的耳蜗管显着缩短。 此外，GATA3的丧失改变了感觉器官形成期间耳蜗中基因的表达模式。 此外，螺旋神经节神经元（SGNs）在GATA3缺失小鼠中大部分缺失。 我们的研究结果表明，GATA3在内耳发育中起到重要作用，通过指定耳蜗中的前体结构域并控制SGNs的存活，并支持GATA3在HDR疾病中的作用。

结果

GATA3在发育中的小鼠内耳中表达

哺乳动物内耳是一种高度保守的结构，共有六种感觉器官28。五个前庭感觉器官包括在相应的基地的三个嵴前，外侧和后半规管，以及位于中央前庭内的心室和囊状黄斑。感觉器官Corti的器官被安置在耳蜗内。 内耳中的所有这些结构都由耳基板发育而来，该基板通过E9.5内陷形成球形耳囊。otocyst经历了一系列的发展，包括区域专业化和复杂的形态转换，形成高度专业化的内耳，调节听力和平衡28-29。

为了研究GATA3在内耳发育中的作用，我们首先通过抗GATA3免疫组织化学详细描述发育中的小鼠内耳中GATA3的时空表达模式。为了研究GATA3在内耳发育中的作用，我们首先详细介绍了GATA3的时空表达模式。用抗GATA3免疫组织化学方法观察发育中的小鼠内耳。在E9.5时，GATA 3在整个耳囊肿中强烈表达(如图所示)。1A)。在E10.5和E11.5时，GATA3的表达仅限于耳囊肿的背外侧和中腹部。1B和C)。在E12.5时，GATA 3在耳蜗管和选定的CVG细胞中广泛表达(见图)。在E13.5至E18.5之间螺旋神经节细胞和耳蜗管中均有表达。（图1E-H）。

为了进一步评估GATA3在发育中神经节细胞中的表达模式，我们用两种CVG标记物共同标记GATA3，NEUROD和ISL130。 在E9.5时，当成神经细胞开始从耳囊的腹侧区域分层并形成CVG时，GATA3在大多数NEUROD细胞中表达（图1）。,当CVG结构在E10.5至E12.5更加确定时，以NEUROD CVG的比例检测到GATA3表达（图1）,1J-L）。 与pan-CVG神经元标记物ISL1共免疫染色也揭示了CVG神经元选择组中的GATA3表达（图1）,1M-P）。最后，我们用TUJ1（一种成熟的神经标记）共同标记了GATA3，发现GATA3在SGNs中高度表达（图1）,1Q-T）。 总之，这些结果表明GATA3在整个耳蜗和螺旋神经节的发育过程中持续表达，表明GATA3在内耳发育中的作用。

特异性敲除小鼠内耳中的GATA3

为了研究GATA3在内耳发育中的作用，我们使用loxP序列在Exon4侧翼产生了GATA3条件性敲除小鼠（图1，2A和B）。由于GATA3基因的外显子4编码对于DNA结合很重要的第一个zing指序基序，所以除去该区域产生了非功能蛋白并且此外在Exon5中引起读框移位和提前终止密码子。我们使用Pax2CRE驱动线，其在发育中的otocyst中表达Cre重组酶31，有条件地使发育中的内耳中的GATA3失活。 与E9.5野生型对照的耳上皮细胞中观察到的GATA3核表达相比，抗GATA3免疫标记在GATA3缺失小鼠的耳囊中未检测到GATA3的特异性核表达（图3）。2C-F）。这些结果表明，Pax2CRE驱动系在内耳发育早期有效地删除了GATA3loxP位等位基因。 此外，我们注意到GATA3无效小鼠在出生后不久死亡，这可能是由于Pax2CRE也驱动Cre重组酶表达的肾功能障碍。 最后，与野生型小鼠相比，来自出生后第27天的GATA3杂合子小鼠的重量显着低于野生型对照（图S1），这可能是由于GATA3杂合子中甲状旁腺功能异常14。

图1.在发育中的小鼠内耳中GATA3的表达。（A）通过耳泡的横切片的免疫标记显示GATA3在E9.5的整个耳囊中表达。（B和C）在E10.5和E11.5处，在otocyst的背外侧区和腹内侧区中检测到GATA3的表达.（D）在E12.5，GATA3广泛表达于腹侧耳蜗管并部分在CVG中表达。（E-H）从E13.5开始，GATA3在SG和耳蜗管中强烈表达。（I-L）共免疫标记显示在E9.5至E12.5的CVG中GATA3表达与NEUROD的部分重叠。M-P）GATA3类似地在E10.5-E12.5的ISL1 CVG细胞子集中表达。（Q-T）GATA3和TUJ1的免疫标记显示GATA3从E12.5以SG连续表达。 OV，耳泡; CD，cochlearduct; CVG，耳蜗 - 前庭神经节; SG，螺旋神经节; D，背部;男，内侧; V，腹部; A，前面; L，侧面。比例尺，50毫米。

体内感觉器官发育不良

从下载http://hmg.oxfordjournals.org/ 于2013年7月25日在杭州师范大学举行

GATA3-缺失耳蜗

我们首先分析了GATA3条件性敲除对耳蜗的影响。在野生型小鼠中，当耳蜗在E18.5时达到其成熟长度时，其大约为一和四分之一圈，并且在中耳蜗水平处的矢 状切面在四个位置穿过耳蜗管（图4）。相反，在在GATA3无效小鼠中只观察到一个小而短的耳蜗管，没有明显的弯曲，矢状切片显示GATA3无效突变小鼠中存在杂乱的耳蜗管（图，3E）。为了评估GATA3缺失小鼠的耳蜗中的细胞缺陷，我们使用SOX2和MYO7A分别鉴定支持细胞和耳蜗毛细胞。 与SOX2和MYO7A共标记GATA3显示在对照耳蜗E18.5，GATA 3在支持细胞中高表达，在毛细胞中弱表达。（图，3A-D和I-K)。MYO7A标记的毛细胞沿着整个耳蜗线圈长度，三排OHCs和一排IHCs在Corti器官中排列成四排（图1）3A-D，）。 在缺乏GATA3的情况下，耳蜗中存在不同的表型缺陷，并且形成类似柯蒂样结构的器官，其中一些包含支持细胞但没有毛细胞（图1）3E和F）或含有支持细胞和可变数量的毛细胞（图1）3和H）。 除了异常数量的支持细胞和毛细胞之外，GATA3缺失小鼠中毛细胞的有序排列被破坏（图1）3L-N）与野生型对照相比，三行OHC和一行IHC沿耳蜗管排列（图1）3L-K）, 这些结果表明GATA 3对Corti器官的正常发育具有重要意义，GATA 3的断裂导致耳蜗导管发育不全或形成异常。

图2.小鼠内耳特异性敲除GATA3。（A）显示GATA3基因组结构，限制性图谱和产生GATA3loxp位小鼠的策略的示意图。黑框代表外显子4编码序列。 粗棒是用于在靶向载体中产生同源臂的序列。 靶向载体的设计是针对外显子4的其中一个位点，即编码第一个锌指突变的插入位点（whitearrowheads）。 Theneomycinresistancecassette（Neo，用于阳性选择）侧翼为FRT位点（黑色箭头），可以通过与FLPe表达小鼠杂交而去除。（B）野生型，杂合子和纯合子GATA3条件敲除小鼠的PCR分析（C-F）免疫标记分析显示GATA3在GATA3缺失小鼠的囊肿中有效缺失。 在野生型小鼠中，GATA3在耳上皮细胞（C和D）的核中高度表达。 然而，GATA3的特定核表达在GATA3无效囊肿（E和F）中被消除。OV，耳泡。D，背部; 男，内侧。比例尺，20毫米。

GATA3-缺失导致内耳中前感觉区域的发育缺陷

Corti器官起源于脊髓腹侧的一个区域，由两个非感觉区域（神经侧的Koliker器官和神经侧的外侧沟）32。观察到的GATA3空耳蜗Corti缺陷表明GATA3可调节prosensory结构域的规范。 因此，我们首先研究了GATA3空耳蜗的形态学缺陷。 而E13.5时宽型小鼠的耳蜗大约一转（图1），4A），GATA3无效耳蜗较短而没有明显转折（图1），4B-D）。此外，GATA3空耳蜗在顶点区域表现出一定程度的分叉（图1）4B-D）。然后，我们检查了已知的前列腺标志物如SOX2（3,33）被改变了。在E12.5的野生型对照中，SOX2在腹侧耳蜗管中表达，大部分重叠表达。

图3. GATA3缺失小鼠内耳中的异常毛发和支持细胞模式。在E18.5时，共免疫标记显示GATA3在支持SOX2的细胞和MYO7A毛细胞中表达。抗MYO7A标记揭示野生型小鼠（A-D和I-K）中有序排列的三排OHC和一排I

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 15 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[281572]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章