从尼日利亚不同传统发酵食品中分离的产淀粉酶植物乳杆菌和发酵乳杆菌的高效新菌株外文翻译资料

 2023-01-04 10:28:18

从尼日利亚不同传统发酵食品中分离的产淀粉酶植物乳杆菌和发酵乳杆菌的高效新菌株

原文作者 A.I. Sanni a, J. Morlon-Guyot b, J.P. Guyot b,*

单位 尼日利亚伊巴丹大学植物学和微生物学系食品和应用微生物学实验室

摘要：从尼日利亚传统发酵食品（fufu、burukutu、ogi-baba 和 kunu-zakki）中分离出淀粉分解乳酸菌 (ALAB) , 旨在筛选高效产淀粉酶菌株。根据表型和分类分子特征对 9 个分离株进行了鉴定。通过 发酵特征和DNA 限制性内切酶分析，可将其分为三组。虽然发酵图谱很好地鉴定了菌株 K9（第III组的唯一代表）为发酵乳杆菌，但它们不能用于确定组 I 和组 II 菌株的分类位置。通过对部分 16S rRNA 序列的分析，确定这些类群为植物乳杆菌菌株，并证实菌株 K9 的种类为发酵乳杆菌。植物乳杆菌的两个不同表型群在使用 D-木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖方面存在差异，并且与先前描述的从刚果脱胶木薯中分离出的解淀粉植物乳杆菌 A6 不同。发酵乳杆菌 K9 与从贝宁玉米酵母中分离的发酵乳杆菌 OgiE1 和 Mw2 不同,它是首次从尼日利亚发酵产物中分离到的解淀粉型发酵乳杆菌。酶谱显示相似发酵组的菌株之间存在一定差异。此分离株最相关的特征之一是比先前报道的在相同条件下生长的 ALAB 有更高的淀粉酶产量。此外，所有分离株均耐受 pH 2 和胆盐。

关键词：乳酸杆菌；乳酸发酵；木薯；谷物；植物乳杆菌；发酵乳杆菌；淀粉酶；

1. 引言

关于乳酸菌 (LAB) 在非洲萨赫勒亚区淀粉食品发酵过程中的优势和有益作用得到了普遍认同，这些食品是用谷物（Akinrele，1970 年；Steinkraus，1995 年；Odunfa 和 Adeyele，1985 年；Chavan 和 Kadam，1989 年；Hounhouigan 等人，1993a）或木薯（Okafor，1977 年；Ngaba 和 Lee，1979 年；Nwankwo 等人，1989）。由于木薯和谷物主要由淀粉组成，因此能够降解淀粉的淀粉分解乳酸菌 (ALAB) 在低、易发酵糖的食品基质中是有益的 (Johansson 等人,1995；Agati等人,1998)。根据 Sanni (1993)，Sanni 等人（1994）、Olasupo 等人（1996）和 Kimaryo 等人（2000），在木薯或谷物面团中大量接种一株或多株乳酸菌可以改善对发酵的控制，提高产品质量。

迄今为止，从非洲淀粉类发酵食品中分离出的ALAB相对较少。Hounhouigan等人 (1993b) 提到来自贝宁的mawe中很少有淀粉分解乳酸菌，而 Johansson 等人(1995) 报告中显示ALAB占从尼日利亚ogi中分离的总LAB的14%。Nwankwo等人(1989) 和 Giraud 等人(1991) 分别从尼日利亚和刚果的浸湿的木薯中分离出了分解淀粉的植物乳杆菌菌株，而从贝宁的mawe和ogi中分离出了分解淀粉的发酵乳杆菌（菌株OgiE1和Mw2）(Agati等人，1998)。Olasupo等人还从加纳的kenkey（发酵玉米面团）和nono（尼日利亚）中分离出了ALAB（1996）。至于尼日利亚的发酵食品，虽然一再报告了ALAB的发生，但没有详细的资料可以对不同来源的菌株进行比较，以便区分和选择有效的淀粉酶产生菌。此外，即使是从相同的微环境中分离出来，在相同的 LAB 种属 (Molin等人,1992,1993) 中观察到的一些典型特征（例如糖发酵模式）的变化，强调需要从不同的发酵食品和地理区域中系统隔离 ALAB。

为进一步与一些描述良好的ALAB菌株和新分离株进行比较，并为有效的淀粉分解菌株选择建立基础，本工作结合使用表型和分子分型方法和生理学数据报告了从尼日利亚传统淀粉类发酵食品：fufu、burukutu、ogibaba 和 kunu-zakki 中分离的ALAB菌株的分离和特性。

  1. 材料与方法

2.1. 发酵食品

在发酵的不同阶段，从当地生产商处无菌采集所选传统发酵食品的样品。将其带到实验室，并保存在5℃条件下，等待微生物分析。发酵食品为：fufu，一种发酵的木薯泥；burukutu，一种用发芽的高粱制成的酒精饮料；ogi-baba，一种用高粱谷物制成的发酵稀粥；kunu-zakki，一种用土豆泥和小米谷物发酵混合物制成的非酒精饮料。除kunu-zakki外，有关产品传统制剂的信息均有详细记录(Faparusi等人,1973；Oyewole and Odunfa,1990；Johansson等人,1995)。

2.2. 分离程序

对于所有样品，使用均质器将10 g食品样品均匀溶解在含有9permil;(w/v) 氯化钠的90 mL无菌蒸馏水中。将适当的十进制稀释液与熔融的 MRS 琼脂培养基 (DeMan等人,1960) 混合，并平行多次进行倾注平板培养。然后在厌氧瓶中于30℃孵育平板48h。分离菌落反复划线获得纯培养物。在MRS琼脂培养基上，以2% (w/v) 马铃薯可溶性淀粉作为唯一碳源，制备各纯种分离株的单菌落，并按照上文所述进行培养。培养板倒满卢戈氏碘液，检测淀粉水解。淀粉分解菌株常规保存在5℃的MRS斜面培养基上，每周连续转移2次。

2.3. 形态学和生化特征

通过相差显微镜观察细胞形态，同时按照 MorlonGuyot等人所述测定革兰氏反应和过氧化氢酶活性确定（1998年）。采用 API 50 CH和API CHL培养基检测分离株的糖发酵能力。使用相应的APILAB Plus数据库和软件进行物种的假定鉴定。使用API ZYM试剂条 (BioMe rieux,Marcy-l Etoile) 测定酶活性。在含不同盐浓度（2、4、6.5和10 w/v）的液体MRS培养基中孵育24和48 h后，用OD600 处的阳性生长，测定出分离株对 NaCl 的耐受性。在含1.5g/L牛胆汁的MRS培养基中孵育12和24 h后（OD600）测定出分离株对胆盐的耐受性。在MRS肉汤培养基 (pH 6.5) 中培养12和24h后接着在pH 2.0 的MRS肉汤培养基中培养2h，测定pH耐受性。在这些实验中，菌株在液体MRS培养基中常规生长。所有实验均重复两次。

2.4. 16S rRNA的基因组DNA限制性模式分析及部分序列分析

如Agati等人(1998)所述，在I 组（菌株C5和BK7）、II组（菌株C6和OB8）和III组（菌株 K9）中对选择的表型不同的分离株进行基因组DNA限制性模式分析（见第三节）。

根据DSMZ(Deusche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen,Germany) 给出的以下方案进行 16S rRNA 的部分序列分析。采用PCR扩增的16s rDNA直接测序法测定各细菌群代表菌株的部分16s rRNA基因序列（450个核苷酸）。按照Rainey等人所述进行基因组DNA提取、16S rDNA的PCR介导扩增和PCR产物的纯化（1996）。使用 ABI PRISM 染料终止子循环测序反应试剂盒(Applied Biosystems,Germany)对纯化的PCR产物进行测序。使用 Applied Biosystems 373A DNA测序仪对序列反应进行电泳。将所得序列数据放入比对编辑器ae2 (Maidak等人,1999) 并手动比对。然后将其与属于乳酸菌科的代表性生物的16S rRNA基因序列进行比较（Maidak等人，1999）。

部分16S rRNA序列数据保存在GenBank，登录号如下：植物乳杆菌C5为 AF382389，植物乳杆菌OB8为AF382390，发酵乳杆 K9为AF382391。

2.5.发酵研究

淀粉发酵在250ml锥形瓶中于30℃进行，重复两次，无pH值控制。采用含 20 g/L 可溶性淀粉 (Prolabo-Merck Eurolab) 作为碳源的MRS肉汤培养基，并接种10% (v/v)过夜肉汤培养物（在与发酵相同的培养基中繁殖）。按照 Calderon 等的方法计算比生长率和淀粉酶产率（2001）。

2.6.胞外淀粉酶活性

如Giraud等所述，通过测定淀粉的碘络合能力，定期采集离心发酵液的上清液测定淀粉酶活性（1994）。在进行淀粉酶活性测定之前，在pH值和温度范围分别为4 -7和30 -80℃、测定时间为 10 min 的条件下，用培养12 h的上清液测定工作菌株OB8、C5和K9（见第 3 节）的淀粉酶活性的最佳条件。pH为6.0和温度为65℃对植物乳杆菌菌株最适，而pH 4.0和45℃温度对发酵乳杆菌K9菌株最适。因此，淀粉发酵研究的淀粉酶活性是在每种菌株的特定条件下进行的。一个酶单位(U)定义为30 min内水解10 mg淀粉的酶量。

2.7.生长测量和生物量估算

使用 Spectronic 20D 分光光度计测量 600 nm波长下的光密度(OD600)。在无菌培养基中适当稀释细胞培养物，以获得低于0.4的OD600，并建立每个菌株的OD600和细胞干重之间的校准曲线。

2.8.分析

采用酶试验组合(Roche Diagnostics,Meylan,France) 估算乳酸的DL形式。采用Waters 2410 折射率检测器，通过 HPLC (Waters,Milford,MA,USA) 分析上清液中的总乳酸、乙酸和乙醇。以硫酸 (6 mmol/l) 作为洗脱液，流速为0.8 mL/min，流速为65 C。通过测定碘-淀粉络合物的颜色 (Nakamura，1981) 测定残留淀粉，同时采用 DNS 法分析还原糖 (Miller，1959)。

  1. 结果
    1. 菌株的一般特性

从kunuzakki、ogi-baba、burukutu和fufu中共获得了9个在 MRS淀粉平板上表现出相对较强的淀粉分解能力的分离株（透明圈超过1cm）。细胞呈革兰氏阳性，不运动，过氧化氢酶阴性，无芽孢形成。它们以短杆状、单个、成对或短链状出现。其中一个菌株(K9)具有相对较长的短链棒。所有分离株均能耐受所用的胆盐浓度，并证明在pH 2的MRS肉汤中孵育2h后，在MRS肉汤培养基中生长恢复（pH 6.2，孵育24h）（结果未显示）。所有分离株均在15℃下生长，但在45℃下不生长。在10%NaCl浓度下未观察到任何菌株生长（数据未显示），而在6.5%NaCl下，除菌株K9外，所有菌株均呈阳性生长。

表 1 尼日利亚发酵食品中分离的淀粉分解乳酸菌碳水化合物发酵谱

与作为参考的淀粉分解菌株进行了比较：植物乳杆菌A6(Giraud等,1991)；发酵乳杆菌OgiE1和Mw2(Agati等,1998)；对于菌株OgiE1，淀粉发酵在API 50 CH上为阴性，在淀粉琼脂培养基上为阳性。属于相同种属的菌株的共同阳性特征被归入相同的方框中。

    1. 糖发酵和酶活性特征

分离株在API 50 CH上的糖发酵能力见表1，根据获得的图谱，鉴定出3个群，群Ⅰ：菌株K1、K2、K3（来自kunu-zakki），C4、C5（来自fufu），BK7（来自burukutu）；群 Ⅱ：菌株C6（来自fufu），OB8（来自ogi-baba）；群Ⅲ对应单一菌株：K9（来自kunu-zakki）。Ⅱ群菌株与Ⅰ群菌株的区别在于发酵D-木糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖和蜜三糖的能力不同。与组I和组II的菌株相比，菌株K9（组 III）发酵的碳水化合物较少。除菌株K9不发酵糖原外，所有菌株均发酵淀粉和糖原。所有菌株均产生不同浓度的DL-乳酸。Ⅰ群的菌株C5的DL比值为：72.7/27.3%,Ⅱ 群的菌株OB8为：63.5/36.5%,Ⅲ 群的菌株K9为：84.3/15.7%。酶谱显示同属的菌株间变异性较大（表2）。例如，组I和组II的菌株发酵N-乙酰-b-氨基葡萄糖（表1），而 8 个菌株中仅检测到 5 个菌株的N-乙酰-b-氨基葡萄糖苷酶活性（表 2）。糖基化酶的主要活性与碳水化合物发酵谱一致。菌株C6、OB8和K9的beta;-半乳糖苷酶和alpha;-半乳糖苷酶（蜜二糖）的产生均与菌株C6、OB8和K9的乳糖发酵能力和alpha;-半乳糖苷酶（蜜二糖）的产生有关，但均不产生棉子糖。b-葡萄糖苷酶活性与组Ⅰ和组Ⅱ所有菌株发酵纤维二糖、苦杏仁苷、龙胆子二糖、水杨苷、熊果苷和七叶苷的能力一致，a-葡萄糖苷酶活性与所有菌株发酵麦芽糖的能力一致。

表型性状的数值分析不能用于确定组I和组II中分离株的种属。APILAB Plus 软件提议将这些菌株鉴定为乳酸乳球菌，鉴定id%在66 -99%范围内，或鉴定为id较低的植物乳杆菌(9.3 -21%)。菌株K9经鉴定为发酵乳杆菌，id为93.7%

表 2 从尼日利亚发酵产物中分离的淀粉分解乳酸菌的 APY ZYM 酶活性特征

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