水稻纹枯病抗性QTL定位和验证
原文作者Fumio Taguchi-Shiobara* 1) , Hidenobu Ozaki 2,4) , Hiroyuki Sato 3,5) , Hiroaki Maeda 2,6) , Yoichiro Kojima 2,7) ,Takeshi Ebitani 2) and Masahiro Yano 1)
(1)National Institute of Agrobiological Sciences, 2-1-2 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8602,Japan
(2)Toyama Prefectural Agricultural, Forestry amp; Fisheries Research Center, 1124-1 Yoshioka, Toyama, Toyama 939-8153, Japan
(3)National Agriculture and Food Research Organization (NARO) Institute of Crop Science, 2-1-18 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8518, Japan
(4)Present address: Agricultural Food Product Division, Toyama Prefecture, 1-7 Shin Sougawa, Toyama, Toyama 930-8501, Japan
(5)Present address: NARO Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, 496 Izumi, Chikugo, Fukuoka 833-0041, Japan
(6)Present address: Takaoka Agricultural Forestry Promotion Center, 211 Akasofu, Takaoka, Toyama 933-0806, Japan
(7)Present address: Agricultural Technology Division Regional Extention Center, 1124-1 Yoshioka, Toyama, Toyama 939-8153, Japan
摘要：纹枯病，是由立枯丝核菌引起的，是水稻最严重的疾病之一。实验所用的33种杂交水稻种，主要来自于农业生物科学研究所（NIAS）的核心种质，我们从喜马拉雅发现了三个品种具有抗鞘枯病3年的田间试验，分别是Jarjan，Nepal 555 和Nepal 8。我们采用回交自交系（BILs）进行QTL分析，该BILs来自jarjan和领先的日本品种越光的杂交种。由于后期数据显示较少的病变，我们只能使用早抽穗BILs来避免与抽穗期相关。我们发现8个QTLs；其中Jarjan的三个等位基因的抗性增加。只有一个位于9号染色体上（在标记 Nag08KK18184 和Nag08KK18871之间）的QTL在三年中都被检测到。而带有它的染色体片段代换系（CSSL）在田间试验中也表现出了抗性。而采自越光和一个CSSL的杂交的30个F2代也证实了这一QTL。
关键词：水稻纹枯病抗性，水稻，QTL，染色体片段置换系，CSSL，立枯丝核菌
引言：纹枯病，由立枯丝核菌引起，是水稻的主要病害，在世界许多地方其严重性仅次于水稻稻瘟病（Rush 和Lee 1992）。这种土传病原具有广泛的宿主范围并且分布于全球，感染植物32多个科188属(Gangopadyay 和Chakrabarti 1982)。在热带和温带气候条件下的许多水稻种植国，鞘枯病会导致许多水稻产量和稻米品质的严重损失(Banniza和Holderness 2001)。温暖潮湿的天气，密集的种植和高氮的投入，更是加剧了这一状况(Hashiba 和 Kobayashi 1996).
即使许多品种和家系已被报告为有前途的抗性资源，水稻遗传资源并没有得到全面的利用以提高抗白叶枯病的抗性(Srinivasachary et al. 2011)。在生产的QTL分析混合种群中，几个来源已被使用，包括特青 (Li et al. 1995, Pinson et al. 2005)、素馨85 (Liu et al. 2009, Pan et al. 1999, Zou et al. 2000)、叶青8(Kunihiro et al. 2002)、明恢63(Han et al. 2002)、早籼19 (Che et al. 2003)、WSS2(Sato et al. 2004)、特特普(Channamallikarjuna et al.2010)和佩科斯(Sharma et al. 2009)。有些已经被用于供开发近等基因系(NILs)或者染色体片段置换系(CSSLs) 去识别可以大幅提高抗性的QTL。Yin et al. (2009)中显示在qSB-9中，一个位于标记RM242和 Y92.5 之间的3.9-Mb特青片段(在9号染色体上的纹枯病抗性QTL)在Lemont背景区域抗性增加。Wang et al. (2011) 则发现在RM245和9号染色体末端之间一1.8-Mb区域的qSB9-2 (Rice Annotation Project et al. 2008)以及在12号染色体上一7.9-Mb区域的qSB12-1抗性增强。
鞘枯病的发展不仅反映了植物的基因型，而且反映了植物的密度和分蘖数以及气候变化的温度和湿度(Hashiba and Kobayashi 1996)。早熟品种比晚抽穗的更容易出现病症，因为晚夏的条件不太利于鞘枯病的发展。纹枯病抗性的QTL经常在同一地区的抽穗期被检测到(Li et al. 1995, Pinson et al. 2005, Sharma et al. 2009)：不同成熟时期的栽培品种，在同一时间点被栽种时，抗性的差异会变小(Lee and Rush 1983)。QTL也被用于检测在同一地区的植物高度(Li et al. 1995, Pinson et al. 2005, Sharma et al. 2009,Zou et al. 2000)：当最高病变的高度与植物高度的比值被用来作为评估标准时，抗性更高的植物更容易取得更高的抵抗力。
为了寻找新的水稻纹枯病抗性资源来用于品种改良，我们从喜马拉雅筛选并鉴定出三份抗性品种：Jarjan, Nepal 555 and Nepal 8。选取Jarjan（J）和越光（K）之间的杂交种用于回交自交系（BILs）来进行QTL分析，我们检测到每三年都有一个相同的QTL。该QTL的效果则通过CSSLs的田间测试进行现场试验验证。
1材料和方法
1.1植物材料
我们筛选了33份水稻抗白叶枯病材料（表1），其中27份来自于保存在NIAS基因库中的农业生物科学研究所（NiAs）的核心种质(Ebana et al. 2008,Kojima et al. 2005)。其它6份包括领先的日本品种越光，抗病品种WSS3,特特普 (Ohuchida et al. 2008, Wasano 1988)以及感病品种Lemont。这些材料在2008年，2009年和2010年被种植在富山县农业领域、林业和渔业研究中心、富山，在3月底播种，并在四月23 - 25号进行移植。每年每份材料进行两次重复，对每次重复的15株进行评估。此外，我们扩展了95个BILs (BC1 F5 : J/K//K; Abe et al. 2011, Taguchi-Shiobara et al.2011）来发现从2009年到2011年的QTLs。
我们将越光同Jarjan杂交和回交得到的F1植株同越光得到22个BC1F1植株。分子标记辅助选择显示，这些植物在DNA标记位点9号染色体上的RM122和RM6971之间有外源基因（靠近纹枯病抗性候选QTL；详见结果），然后我们将BC1F1同越光回交得到BC2F1植株。两代自交和标记辅助的选择使用了152个简单重复序列（SSR）标记5个BC2F3植株，该植株被选择用作与Jarjan的9号染色体上6处标记的等位基因进行CSSLs，该区域全部或部分覆盖有纹枯病抗性的QTL（为了方便记为qSBR-9）。这5个CSSLs，qM1和 qM3-qM6，在2010年和2011年在富山作田间评估。
一个CSSL，qM1，用于单核苷酸多态性（SNP）的768个SNP分型 (Ebana et al. 2010)，在2010年筑波的国家作物科学研究所的Yawara低地实验站进行田间评估。这一CSSL同越光杂交产生BC3F1植株。从这些植株中，我们挑选出15株同Jarjan等位基因在qSBR-9进行置换，而另选15株同越光等位基因进行置换。这30个植株自交得到BC3F2，并于2011年在富山进行了田间评估。
Table 1. List of 33 accessions used in 3 yearsrsquo; field testing for resistance to sheath blight
1.2抗纹枯病的抗性评价
选用两种水稻纹枯菌，CS-2和90W-14。CS-2保存在筑波，90W-14分离自爱知县的田间，被保存在富山和筑波（附表1）。每种都在—20°C的环境下被保藏在大麦中（Gaskill 1968, Naito et al. 1993）。
采用两种方法进行田间试验（附表1），所用的主要方法是将受感染的稻壳撒于土壤中。病原菌在28°C的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上（PDA）培养几天。长出的菌丝在28°C的 PDA培养基上培养14天后再传至另一个培养基培养14天。菌丝培养基碟中加入75g稻壳，75g麸皮和150ml聚胨溶液（1% w/v），混合，室温孵育。21天后，将易感染的培养基与300g稻壳混合，撒在400个植株中，共四排（每排15株，植物之间间隔25cm长和12.5cm宽）。在六月下旬和七月上旬之间，所有行每隔9天左右接种，共接种三次，要在淹水条件下，在白天没有风或降雨的时候接种。一行中只有10个或15个植株进行评价。我们记录每株的分蘖数和病变数，并计算病变比例及平均值。取相对株高最高的病变高度比例作为相对病变高度（%）。
我们还通过注射进行接种(Sato et al. 2004,Wasano et al. 1983)。菌丝培养在含有1%（w/v）蛋白胨的马铃薯蔗糖琼脂培养基中。将均匀分布菌丝的培养液注入在抽穗期的棋叶下的第三片叶鞘。在接种后28天，记录病变面积相对第二片叶总叶鞘区的的比例，每株计算三片叶，再计算平均值。
1.3 QTL分析和统计分析
利用MAPMAKER/EXP 3.0软件，从基因型数据中构建连锁图谱(Lander et al. 1987)。通过使用软件的Kosambi比对功能估计遗传距离。QTL分析是通过采用QTL Cartographer 2.5软件来进行复合区间映射。全基因组的阈值(alpha; =0.05)被用来检测在1000个序列结果基础上的假定存在的QTL (Churchill and Doerge 1994)。
我们使用Microsoft Excel 2007 提供的F-test 和 t-test将 BC 2 F 3 (J/K//K)，F 1 (K/qM1)， 或者BC 3 F 2系(J 或 K 等位基因)与其他种或者生长在同一田间的越光进行比较，同时与BC 3 F 2系(J 或 K 等位基因)彼此比较。我们使用JMP v. 10软件中的Tukey多重比较检验去比较 4个BC 2 F 3系 (qM3-qM6)和越光的穗数(SAS Institute, Cary, NC, USA)。
标记的位置是根据国际水稻基因组测序项目的序列(IRGSP)，建立5个伪分子的水稻基因型(Rice Annotation Project et al. 2008)。
2实验结果
2.1 33份水稻抗纹
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