抗坏血酸积累是芜菁抗病品种对芜菁花叶病毒的一种防御反应外文翻译资料

 2023-01-07 10:39:07

抗坏血酸积累是芜菁抗病品种对芜菁花叶病毒的一种防御反应

Ayaka Fujiwara, Satoko Togawa, Takahiro Hikawa, Hideyuki Matsuura, Chikara Masuta and Tsuyoshi Inukai

Hokkaido University

摘要：我们最初观察到含有芜菁花叶病毒(TuMV)抗性基因Rnt1-1的芜菁品种，在感染TuMV时积累了高水平的内源性抗坏血酸(AS)和脱氢抗坏血酸(DHA)。我们在此假设AS DHA (TAA)水平升高可能有助于rnt1 -1介导的抗性，并使用芜菁和拟南芥植物进行了一系列的实验。在敏感品种上应用l-半乳糖(AS合成的关键底物)可使TAA水平提高~2倍，同时也可在一定程度上增强病毒抗性。证实TAA水平与病毒抗性之间存在一定的正相关性，我们分析了AS通路中的两个拟南芥敲除突变体(ao和vtc1);ao和vtc1植株的TAA水平分别有显著升高和降低。ao植株对TuMV的抗性增强，vtc1植株比对照植株更敏感，支持我们的假设。当我们分析TuMV感染时AS通路相关基因的表达谱时，我们观察发现TAA的增加主要是由AS氧化还原减少和AS循环活化所致。然后我们研究了在病毒感染时调控内源性TAA水平的第二信号，发现茉莉酸(JA)可能在TAA积累中发挥重要作用。综上所述，我们推断芜菁植株中TAA积累升高至少在一定程度上是由依赖JA的信号通路介导的，可能对病毒抗性有显著影响。

关键词：抗坏血酸氧化酶； 抗坏血酸过氧化物酶； 抗坏血酸；芜菁；脱氢抗坏血酸还原酶；茉莉酸；芜菁花叶病毒

引言

l -抗坏血酸(AS)是在植物抗氧化系统中发挥作用的主要化合物，目前以毫摩尔水平存在于植物细胞内(Zechmann,2011)。与只有单一AS合成途径哺乳动物相比(Linster and Schaftingen, 2007)，植物有四条AS合成途径(Gallie, 2013a)。以d-葡萄糖6-磷酸为起始底物的甘露糖/半乳糖通路是AS主要合成途径，并且已有几种替代途径被发现 (Gallie, 2013b)。在循环途径中，也要保持AS池的大小，氧化形式的AS，单脱氢抗坏血酸(MDHA)而脱氢抗坏血酸(DHA)，分别由MDHA还原酶(MDHAR)和DHA还原酶(DHAR)还原为AS (Gallie, 2013b)。

在转基因植物实验中，过表达DHAR使细胞的AS水平显著升高，说明AS的积累除了受到合成途径的限制外，还受到循环途径的限制(Gallie, 2013b)。而AS酶促或非酶促消除有氧代谢过程（如光合作用或非生物胁迫）中产生的活性氧（ROS），该化合物还作为主要还原剂调节细胞氧化还原状态(Foyer and Noctor, 2011)。除了这些功能，AS在细胞分裂中起着重要的作用，细胞伸长或作为乙烯、脱落酸(ABA)或赤霉素(GA)等植物激素合成酶的辅助因子(Gallie, 2013a)。

在一些植物物种中，总抗坏血酸(TAA: AS DHA)的积累随着非生物胁迫下活性氧生成而发生。例如,在10°C低温适应7 天后,菠菜(Spinacia oleracea)叶子的TAA水平比正常情况下的植物高出41% (Proietti et al., 2009)。类似的反应在小松菜(Brassica rapa var. pervidiris)从13 - 15°C转移到2 - 3°C 8天后的叶子中被观察到(Tamura, 1999)。在拟南芥叶片和马铃薯块茎(Solanum tuberosum)中，TAA在损伤后积累，尽管创伤应激的响应模式因物种和组织取样部位的不同而不同 (Suza et al., 2010)。生物胁迫(如病毒感染)也能提高TAA水平。番茄(Solanum lycopersicum)果实经黄瓜花叶病毒((genus Cucumovirus, family Bromoviridae, order unassigned)减毒株感染后，TAA水平上升了约40%(Tsuda et al., 2005)。虽然在非生物和生物胁迫后TAA积累的诱导机制还不清楚，茉莉酸(JA)， 植物激素调控生物和非生物胁迫的反应，据报道作为激活AS合成或循环的信号。拟南芥与烟草(Nicotiana tabacum) (Sasaki-Sekimoto et al., 2005; Wolucka et al., 2005; Suza et al., 2010)。当拟南芥植株经茉莉酸甲酯(MeJA)处理后，发现4个基因(VTC1、VTC2、MDHR和DHAR基因)mRNA水平显著升高与TAA积累增加有关(Sasaki-Sekimoto et al., 2005; Suza et al., 2010)。在烟草悬浮细胞中，经MeJA处理可上调编码鸟苷二磷酸甘露糖 3，5-差向异构酶基因的表达，以及推测参与甘露糖/半乳糖通路的古洛糖酸-1,4-内酯脱氢酶/氧化酶的表达 (Wolucka et al., 2005)。

芜菁花叶病毒(TuMV; genus Potyvirus, family Potyviridae, order unassigned)，感染广泛的宿主，包括重要的经济芸薹品种 (Walsh and Jenner, 2002)。最近，我们利用芜菁（B. rapa subsp.rapa）植物，外源DHA和AS衍生物 L( )-抗坏血酸2-硫酸二钠脱水盐（AS-SO4）和脂溶性抗坏血酸棕榈酸酯（AS-Pal）可用作抗TuMV的抗病毒试剂(Fujiwara et al., 2013)。在目前研究中，我们扩展了我们之前的研究，以阐明内源性AS和/或DHA在芜菁中作为抗TuMV的抗病毒化合物起作用，以及在响应TuMV感染的芜菁植物中诱导TAA积累。因为含有Rnt1-1基因的抗性大白菜（B. rapa subsp.pekinensis）品种(Fujiwara et al., 2011)在接种无毒TuMV菌株时可以高水平积累TAA，我们利用这种病理系统可知抗性芜菁植物可通过调节叶片TAA水平响应TuMV。

材料和方法

植物材料和生长条件

9个芜菁品种 [CR Mochibana, CR Yukibana, Fuku-komachi, Kyo-senmai, Natsu-komachi, Wase-ohkabu (TAKII, Kyoto, Japan), Hakuro, Kyo-no-yuki, and Yukihime-kabu (TOHOKU SEED, Utsunomiya, Japan)]和两个大白菜品种 [Akimasari (ATARIYA, Katori, Japan) and Ku-kai 65 (TAKII)] 用于这次研究中。拟南芥(hereafter, Arabidopsis)野生型哥伦比亚（Col-0），AO基因的T-DNA插入突变体（At5g21100）和VTC1基因的突变体（At2g39770）用甲磺酸乙酯诱导 (Conklin et al., 1999; Yamamoto et al., 2005)。ao突变体（SALK 108854）和vtc1突变体（CS8326）来自拟南芥生物资源中心。将芜菁和大白菜的种子在光照下浸泡2-3天，加速发芽，播种于泥炭颗粒，Jiffy-7（SAKATA，Yokohama，Japan），并在在21℃下用12小时光周期（150mu;molm-2s-1）MLR-350培养箱中生长（SANYO，Tokyo）。将拟南芥种子直接播种到泥炭颗粒中，用保鲜膜覆盖直至发芽，然后以与芜菁相同的方式生长。

病毒接种，检测和定量

表达黄色荧光蛋白的TuMV菌株（YFP）-TuMV-TuR1-YFP-和TuMV毒株UK1 (Saacute;nchez et al., 1998) 分别由T. Natsuaki博士 (Utsunomiya University, Japan)和F. Ponz博士 (INIA, Spain)。我们在实验室获得了携带Rnt1-1的自发突变UK1 m2从UK1毒株到Aki-masari毒株。这些病毒一直保存在芜菁品种Yukihime-kabu中。

将芜菁植物的第二片真叶撒上金刚砂，并在播种后10天用接种物摩擦接种。对于拟南芥，在播种后3周用芜菁相同的方式接种四个成熟的莲座叶。通过计算对TuMV-TuR1-YFP接种的叶子上的感染位点的数量来评估植物中对TuMV的定量抗性的程度。接种 (DPI)3-5天后在蓝光下计数感染部位。对于拟南芥的ao突变体，在未接种的上部叶子上用TuMV-TuR1-YFP接种，接种9天后在蓝光下收集感染的区域并且根据制造商的说明使用TuMV多克隆抗体ELISA测量病毒水平 (Japan Plant Protection Association, Tokyo)。使用微量滴定板读数器ARVO MX 1420（PerkinElmer Japan，Yokohama，Japan）读取405nm处的吸光值。

化学处理

用于该研究中的l-半乳糖，过氧化氢（H2O2）和MeJA (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)，和水杨酸（SA）和ABA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。在接种前5天里每天用刷子将10mM L-半乳糖溶液涂抹于芜菁植物。其他化学物质以不同浓度在芜菁植物的所有地上部分各喷洒一次。在处理后24小时（HPT），收获第二片真叶用于各种分析。对于H2O2，叶子在处理后1,6和12 小时下取样。所有化学处理实验均以水处理实验组为对照。

AS和DHA的测定

将采集的叶子立即用研钵和研杵在5 vols 的6％偏磷酸中研磨。将匀浆以14000rpm离心20分钟，并将上清液储存在-80℃直至分析时。上清液根据2,4-二苯肼法用5％偏磷酸稀释10倍用于AS测定，稀释5倍用于DHA测定 (Bradley et al., 1973)。

定量RT-PCR基因表达分析

使用TRIzol试剂(Invitrogen, Tokyo, Japan)采集的每株植物的第二片真叶的一半按照制造商的说明从中提取总RNA，并用不含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶I (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)处理以除去DNA污染。第二个真实叶子的剩下部分被用来测量AS和DHA水平。参与AS合成，氧化和再循环通路的基因表达模式(Supplementary Table S1; Supplementary Fig. S1 at JXB online)通过用GenomeLAB GeXP Start Kit(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 进行多重RT-PCR测定，如前所述(Kim et al., 2008)。，根据Chen等人(2010) 和Schuller和LudwigMuuml;ller（2006年）的选择将TIP41样蛋白基因，蛋白磷酸酶2A亚基A3基因和肌动蛋白基因作为内标。 AS通路基因的表达水平计算为三种内标基因的相对几何平均值的比率。本研究中使用的引物序列总结于补充表S1中。

酶活性测定

根据Nakano和Asada测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性（1981）。采集B. rapa的第二片真叶，称重，并立即在样品的新鲜质量10倍的提取缓冲液(50mM HEPES, 0.5mM AS, 0.5% Triton X-100, 20% sorbitol, plus 5% polyamide) 中匀浆。将匀浆在14000rpm和4℃下离心15分钟；将上清液再次离心，并将第二上清液用作酶提取物。待测混合物由50mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0），0.5mM AS，0.1mMH2O2,1mM EDTA和酶提取物组成。APX活力为在 25 °C 和 290nm (E=2.8mMminus;1 cmminus;1)下用分光光度计 (U-2000, Hitachi High-Tech Fielding Corp., Tokyo, Japan) 测定1min内底物浓度 (0.5mM AS) 的减少量。 一个酶活性单位定义为在25℃下催化氧化 1 mu;mol AS minminus;1 的酶量。

根据Munyaka等人测定抗坏血酸氧化酶（AO）活性 (2010) ，使用事先制备好的酶提取物用APX相同方法但用含5％聚酰胺的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 5.6, 0.5mM EDTA, 0.75M NaCl, 0.5% Triton X-100, 20% sorbitol) 作为提取缓冲液。待测混合物由0.1M磷酸盐缓冲液（pH 5.6），0.25mM AS，0.5mM EDTA和酶提取物组成。AO活力为在25℃和265nm（E = 14mM-1cm -1）下使用分光光度计测定3分钟内底物浓度（0.25mM AS）的减少量。一个酶活性单位定义为在25℃下催化氧化1mu;molASmin-1的酶量。

事先制备好的用于MDHAR活性测定的酶提取物用APX相同方法使用含5％聚酰胺50mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.5, 0.1mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 20% sorbito

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