有效氮调节脯氨酸和乙烯生产和缓解盐胁迫对芥菜外文翻译资料

 2023-01-10 14:46:46

有效氮调节脯氨酸和乙烯生产和缓解盐胁迫对芥菜

Noushina Iqbal a,lowast; , Shahid Umar a,lowast; , Nafees A. Khan b

摘 要：研究表明盐胁迫下会在植物体内产生脯氨酸和乙烯。为了评估盐胁迫下氮对光合作用的影响，将氮在（0，5，10，20mM）下对芥菜中产生的脯氨酸和乙烯的含量进行研究。在无盐的条件下，通过增加脯氨酸代谢酶让N（10mM）优化其产生量，从而通过增加乙烯生产量来确保渗透压平衡和光合作用。在无盐胁迫下，N（20mM）会抑制光合作用而且造成较高的乙烯释放，但相比在N（10mM）的条件下产生较低的脯氨酸。与此相反，在盐胁迫下同时增加N的需求量，过剩N对乙烯生产量的优化来调节脯氨酸含量使得光合作用的恢复。通过应用乙烯生物合成抑制剂及氨基乙烯基甘氨酸进一步证实了过剩的N对盐胁迫下的光合作用的影响，以此抑制脯氨酸生产和光合作用。在无盐胁迫下，氨基乙烯基甘氨酸促进接收过剩N从而抑制生产应激乙烯植物的光合作用。结果表明，乙烯，脯氨酸和氮的盐耐受性之间存在一个相互调节的作用。氮差异调节脯氨酸生产和乙烯形成以减轻盐度对芥菜光合作用中的不利影响。

关键词：乙烯、氮、光合作用、脯氨酸、盐度

引 言

有效态氮对于植物的生长和发育起重要作用。氮含量大于或小于所需求的量可能延缓或抑制植物的生长。盐渍土壤面积约增加到8000万公顷，这导致全球作物产量大幅度下降(Rengasamy, 2010; Khan et al., 2014)。由于活性氧的过量产生，盐胁迫引起的脂质过氧化，扰乱了植物对水和渗透压平衡以及养分吸收 (Munns, 2005; Fatma et al., 2013; Khan et al., 2014)，甚至破坏了光合作用系统(Fatma et al., 2014; Nazar et al., 2014)。

盐度影响碳和氮在植物中代谢，从而决定了植物生长发育的主要生理过程(Touchette and Burkholder, 2007)。植物对盐胁迫降低营养物质的吸收（如氮、钙 (Ca)、钾(K)）(Reda et al., 2011; Syeed et al., 2011)。盐度和氮的交互作用对植物的光合作用和耐盐性起着重要的作用。曝光在盐胁迫下的植物对氮的吸收减少并降低了光合作用，而添加氮的植物通过增加基质和类囊体蛋白和在盐胁迫下调节气谷运动来提高叶片的光合能力(Syeed et al., 2011; Nazar et al., 2011)。

相容性溶质脯氨酸等的生产已被证明与氮同化和耐盐性有关(Iqbal et al., 2014)。脯氨酸促进水吸收、保持渗透平衡和在盐胁迫下保护细胞对抗活性氧(Ashraf and Foolad, 2007; Filippou et al., 2014; Iqbal et al., 2014)。脯氨酸在植物中的合成发生主要从谷氨酸通过吡咯啉羧酸来完成。脯氨酸通过和吡咯啉羧酸合成酶和吡咯啉羧酸还原酶来催化。脯氨酸降解发生在线粒体通过连续行动的脯氨酸脱氢酶或从脯氨酸与脯氨酸脱氢酶中产生脯氨酸氧化酶。脯氨酸合成的另一个途径是通过鸟氨酸。鸟氨酸先由鸟氨酸氨基酶转移，然后转换为脯氨酸。植物激素也调节氮代谢和脯氨酸生产和调节耐盐性(Iqbal et al., 2014)。乙烯，一种气态的植物激素，扮演着一个重要的角色在耐非生物胁迫中(Abeles et al., 1992; Khan and Khan, 2014)。乙烯可能通过其对氮代谢和脯氨酸产生的影响而参与植物盐耐里。乙烯利(乙烯源)的应用已被证明在不同氮水平下可以增加氮素同化和芥菜在光合作用下的生长(Khan et al., 2008; Iqbal et al., 2011)。报告表明，小麦在生产高温胁迫和镉(Cd)压力下，乙烯调控脯氨酸的生产量。最近，纳扎尔等人(2014年)已经证实在盐胁迫同时增加硫同化和抗氧化代谢，乙烯对光合作用下的芥菜的保护。然而，有关氮的可用性如何调节脯氨酸和乙烯生产和缓解盐胁迫的信息是不可用的。在目前的研究中,我们表明,N可用性差异影响乙烯生产,从而调节脯氨酸合成和保护盐胁迫下芥菜的光合作用。通过乙烯生物合成抑制剂和乙烯基甘氨酸氨基的应用被证实乙烯参与脯氨酸合成的调控和保护盐胁迫下的光合作用。

1材料和方法

1.1 种子与生长条件

芥菜种子来自印度农业研究所。在新德里对这些种子用0.1% HgCl2进行表面消毒并用去离子水反复洗涤。将种子根据休伊特（1966）播种于15厘米直径的陶罐里并填充有酸洗砂，将其纯化。盆栽保持在新德里国家植物学部的草药园中，并将其保持在印度自然日夜条件下昼夜相对温度的24/18plusmn;3℃以及68plusmn;6%的相对湿度环境中。

两种植物每盆都被维护和受到控制条件(0ML氯化钠) 或治疗 (100mM氯化钠，5mM氮，10mM氮和 20mM氮)。在含有100mM氯化钠的300mL营养液或不同的氮水平（5，10，20mM）的营养液进行单独或组合培养。并每隔一天将修正强度后250ml的去离子的霍格兰营养液灌溉。硝酸钾用于获得5，10或20mM NO 3 -的浓度和K 通过加入氯化钾控制浓度来维护所有治疗方法，包括在营养液中生长的植物作为对照实验。每周更换营养液。控制组的植物分别每日饲以300mL营养液或者250mL去离子水。

在实验中使用的乙烯生物合成抑制剂，50微米氨基乙烯基甘氨酸被应用于植物在播种后20天同时加入0.5%表面活性剂阴离子去垢剂后作为叶面喷施。在单独20mM氮和100mM氯化钠中加入20mM氮的条件下，植物吸收氨基乙烯基甘氨酸营养生长。控制方法和之前一样。

实验依循完全随机设计的组别，然后对实验进行四个对照复制(n = 4)。在播种30天后，小心选择相同年龄的叶子进行测定。

1.2 叶中Na 和Clminus;含量的测定

测定消化叶组织 (500mg与19mL的三酸混合物来评估叶子中Na 和Clminus; 含量测定消化叶组织(500mg)与19mL的三酸混合物；16 molL minus; 1混合集中硝酸(10 ML)、18 molL Lminus; 1 浓硫酸 (5mL)和11.65 molLminus; 1 集中氯酸(4mL)编写的比为 10:5:4 (v/v)。Na 含量估计使用分光光度计法，而Clminus;含量测定通过0.02 N硝酸银溶液滴定法，将 5%重铬酸钾作为指示液。

1.3 过氧化氢和硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的含量测定

过氧化氢和硫代巴比妥酸反应物含量分别采用奥田硕等人(Okuda et al.1991)和丁德萨等人(Dhindsa et al.1981)的方法。方法细节已经在前面做了描述 (Nazar et al.,2011)。

1.4 脯氨酸、二氢吡咯-5-羧酸合成酶、gamma;-谷氨酰基激酶、脯氨酸氧化酶活性的测定

脯氨酸含量用茚三酮在分光光度法下测量(Bates et al. 1973 )。新鲜叶片组织（300mg）在3mL的3％磺基水杨酸下进行匀浆。在100℃，每一个毫升酸茚三酮和冰醋酸加入到匀浆滤液和反应进行在试管中，混合物置于水浴1小时，用甲苯萃取，测定吸光度，在520nm处以使用1-脯氨酸作为标准分光光度计测定(UV–vis L164, Elico, New Delhi)。

以确定二氢吡咯-5-羧酸合成酶（EC 2.7.2.11/1.2.2.41），gamma;-谷氨酰基激酶（EC 2.7.2.11）和脯氨酸氧化酶（EC 1.5.99.8）的活性，在pH为7.5，4℃条件下，在0.1Mm三氨基甲烷缓冲液下通过对500mg叶样品匀浆中进行酶提取物的制备。将匀浆离心30分钟。上清液作为原油提取吡咯啉-5-羧酸合成酶活性的酶制剂，被收集的颗粒用作gamma;-谷氨酰基激酶提取物和脯氨酸氧化酶测定。根据 Hayzer和Leisinger (1980)稍加修改的方法测定二氢吡咯-5-羧酸合成酶和gamma;-谷氨酰基激酶的活性。在1毫升测定混合物含有100ml脯氨酸和100Mm钠磷酸盐缓冲液中，其ph值为7.5。在 340nm 吸光度测量的减少量为二氢吡咯-5-羧酸合成酶 。在340 nm处测定二氢吡咯-5-羧酸合成酶的吸光度下降。把提取物保存在minus;20℃的冰箱里用来测量gamma;-谷氨酰基激酶活性。将冷藏的样品悬浮于10ml含有1mM三氨基甲烷缓冲液中，并离心30分钟，使细胞壁细胞膜发生破裂。这种活性测定液中包含50mM谷氨酸，10mM三磷酸腺苷，20mM的氰化钾，100mM盐酸羟胺。脱盐提取的50mM三氨基甲烷, 其pH 为7.0。酶提取液的加入引发上面这一系列的反应。在37℃的环境下，培育30分钟。在2.5M盐酸中加入1 mL三水合三氯化铁和三氯乙酸后反应才停止。蛋白质先沉淀，然后在每分钟12000转的条件（4℃）下离心消除。在540 nm处记录吸光度值与上述空白实验对比，发现缺少ATP。gamma;-谷氨酰羟肟酸酯的量通过测量540nm处的吸光度，并通过与gamma;-谷氨酰异羟肟酸盐的一个标准曲线比较来确定。gamma;-谷氨酰基激酶的蛋白活性为1 Umg。一个单位（U）酶活性定义为产生最小毫克的蛋白。

采用经过稍微修改的Huang and Cavalieri (1979)方案来测定脯氨酸氧化酶的活性。酶提取液离心后分别得到1mL的麦黄酮，含有6 M蔗糖的氢氧化钾缓冲液（pH 7.5)。通过此类提取液来测定酶。这种活性测定液，包含1.2ml的50mM三氨基甲烷缓冲液（pH8.5）,1.2ml的5mM 氯化镁和0.1ml的0.5 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，0.1ml的1 mM氰化钾，0.1毫升的1 mM 吩嗪硫酸甲酯，0.1ml的0.06 mM2,6-二氯酚靛酚和0.1ml的0.1 M脯氨酸，最终得到3ml的溶液。在25℃下600 nm的吸光度下检测发现脯氨酸引发反应，吸光度不断增加。用蛋白的含量多少来表示脯氨酸氧化酶活性程度。

1.5 亚硝酸还原酶的活性和氮含量的测定

使用Kuo et al.(1982)酶提取法来测定叶中的亚硝酸还原酶(EC 1.6.6.1)的活性。采用Nakagawa et al.(1984)程序，在28℃下通过分光光度法测定亚硝酸盐产生速率。过程的细节已经在前面解释过了(Nazar et al., 2011; Iqbal et al., 2012)。

1.6 1-氨基环丙烷羧酸合成酶 (ACS) 活性和乙烯的测定

1-氨基环丙烷羧酸合成酶(EC 4.4.1.14) 活性测定采用Avni et al. (1994)和Woeste et al. (1999)的方法。叶组织（5.0g）被研磨后含有4mM 二硫苏糖醇，2.5mM的磷酸吡哆醛和25％聚乙烯吡咯烷酮的100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（pH 8.0）。制备的匀浆离心15 分钟。将一毫升的上清液置于30毫升管和添加0.1毫升的5mm S-腺苷蛋氨酸，22℃下培养2小时。

1-氨基环丙烷羧酸形成测定其转换为乙烯由20ml氯化汞，并于0.1 毫升的NaOH与NaCl进行1:1 混合。在控制组中，不添加S-腺苷蛋氨酸。乙烯通过加入0.1毫升20mm的氯化汞，再加入1:1的0.1 毫升饱和氢氧化钠或氯化钠混合液进行转化形成1-氨基环丙烷羧酸，并冷至10分钟。

对乙烯、切成小块的0.5克叶样品进行测量，将其放入30毫升管并放置在阳光下2小时用于植物生长。用橡胶帽把试管塞封并放入润湿纸以组织减少。用皮下注射器从试管中吸取一毫升气体样品。用配备有1.8 min Porapak N（80-100目）柱的气相色谱仪(Nucon 5700, New Delhi)检测。氮气被用作载气。将检测器设置在150℃下，发现N，H和O2的流量分别为30，30，和300毫升每分钟。通过保留时间和与来自标准乙烯浓度峰值比较来定量乙烯含量。

1.7 统计分析

资料进行统计学分析采用方差（ANOVA）分析采用SPSS统计学，并作为处理平均值plusmn;SE（N=4）。P＜0.05是最小显著性差异的重要数据。通过最小显著性差异测试，表达信息。

2结论与分析

2.1 盐胁迫下不同氮量的氧化应激差异

土壤含盐量导致的Na 和Cl-的积累造成植物氧化应激。在本研究中，氮素有效性不同程度地影响存在盐胁迫和不存在盐胁迫两者的积累。在没有盐胁迫情况下，与对照组相比，10 mM最大限度地降低Na 和Cl-的含量；与此相反，在存在盐胁迫作用的比较下，20 mM 氮素最大限度的降低的Na 和Cl-的含量。相比于对照（图1）。盐胁迫下培育的植物显示出更高的过氧化氢积累和TBARS，也表现出更大的氧化应激和对照组的植物相比。在没有盐胁迫下，通过10 mM氮素减少氮肥中过氧化氢和TBARS的含量，最大限度减少其植物中含量和在盐胁迫下使用20m

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