查耳酮合酶基因家族在花青素的生物合成和蓝光及紫外线对萝卜（芜菁；十字花科）的光反应中起到一个冗余的作用外文翻译资料

 2023-01-10 14:52:42

查耳酮合酶基因家族在花青素的生物合成和蓝光及紫外线对萝卜（芜菁；十字花科）的光反应中起到一个冗余的作用

黄酮类化合物，包括花青素，是植物主要的花红色素。并且在吸引昆虫来授粉和保护植物的DNA的影响紫外(UV)光中具有重要的作用( Schmelzer et al., 1988 ; Tanaka et al.,2008 )。此外，它们在植物发育、应急保护和提升人类健康方面有着多重角色( Hichriet al.,2011 )。类黄酮的合成收到许多环境的影响，以及光线可以诱导获得花青素的高产量( Harker et al., 1990 )。大多数酶参与了花青素生物合成途径，例如苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、肉桂酸羧化酶(C4H)、查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮异构酶(CHI)、4CL、F3H和DFR在许多模式生物中都被单独隔离和研究( Holton and Cornish, 1995 ; Weiet al., 2011 )。查耳酮合成酶(CHS) (EC 2.3.1.74)在类黄酮生物合成途径中是一个关键的酶，查耳酮合成酶基因的表达是花青素生物合成的决定因素。

CHS在许多植物里都是由一个多基因家族编码的。例如，至少有8个CHS基因是被矮牵牛表达的(ko et al .,1989 b)还有豌豆(Ito et al .,1997)，9个基因家族成员存在于牵牛花（番薯属）中( Durbin et al., 2000 )。以及3个CHS基因存在于拟南芥中( Wang et al., 2007 )，但只有一个基因编码查耳酮合酶( Owens et al., 2008 )。矮牵牛查耳酮合酶基因启动子的激活在之前就被显示是具体的花，依赖光和紫外线的诱导，和受到发育的调控( van der Meer et al., 1990 , 1992 )。CHS的基因差异表达模式被关联到黄酮类化合物合成类型( Lo et al.,2002 )。在许多情况下，一个或两个基因家族中的成员表达了整个CHS基因。矮牵牛CHS基因家族的八个成员之一，一个基因，CHS-A，占总的CHS基因表达的百分之九十，CHS-J占百分之十，CHS-B和CHS-G则占了比较少的部分( Koes et al., 1989a , b )。萝卜（芸薹属）是十分流行的十字花科蔬菜，已经被食用了几个世纪。萝卜中的花青素有抗炎症和抗氧化作用，被认为能使人们保持健康。最近的研究表明，丰富的花青素提取物更有抗癌的作用( Brown et al., 2012 )。

CHS的表达被发现是被发展的环境因素例如成熟的水果，紫外线，和治疗等诱导的( Moriguchiet al., 2001 ; Zhang et al., 2011 )。在豌豆中，CHS基因中的八个成员在发育过程中被差异表达，并且应对各种环境因素，激发子诱导和紫外线反应( Ito et al., 1997 )。在葡萄中的三个CHS基因，CHS1在果皮和嫩叶中累积( Goto-Yamamoto et al., 2002 )，CHS2和CHS3主要在水果色素沉淀后的表皮被表达( Jeong et al., 2004 )。在大豆暗中生长的幼苗中，CHS1，CHS3和CHS4在白光和UV-B的反应下被表达，但是CHS2不会( Shimizu et al., 1999 )。CHS5和CHS6的表达也是由于UV-B ( Shimizu et al., 1999 )，CHS7和CHS8在种子的iso类黄酮合成中起到一个重要的作用( Dhaubhadel et al., 2007 )。

这种遗传冗余似乎在高等植物的基因组中被广泛传播( Nowak et al., 1997 )。最近植物CHS家族中动植物种类史的研究显示CHS基因形成了单独的种群。这些单独的分组显示一个进化的途径涉及了基因复制和基因丢失( Jiang et al., 2008 )。从进化的角度来看，CHS基因功能的重叠意味着它们受到选择压力最小。大多数植物维持着CHS基因的多个副本，它们的差异表达在不同的组织和对一系列环境因素的回应反映了不同生物类黄酮代谢产物在植物中起到的作用( Austin and Noel, 2003 )。

CHS的转录已经被证明是在一个复杂的系统调控下的，并且一些潜在的调控因子已被确定( Hartmann et al., 2005 )。在拟南芥中，ACE，RRE和MRE可以被转录因子HY5，TT8绑定。并且PAP1分别直接影响组织和光敏感基因的表达( Hartmann et al., 2005 ; Lee et al., 2007 ; Dare et al., 2008 )。在烟草中，两个基础的bHLH转录因子（TFs）（NtAN1a和NtAn1b）与R2R3MYBTF （NtAn2）相互作用，激活收到花青素调控的CHS和DFR的启动子( Bai et al., 2011 )。因此，花青素生物合成途径基因的功能可以轻易地在转基因烟草植物的花中被研究。

尽管CHS基因家族在许多植物物种中被确认了，它们表达和调控的潜在机制却还没被阐明。依赖光的花青素生物合成在不同的植物中表明了基因表达中一个常见的调控机制。我们先前还发现了萝卜肿胀的下胚轴，cv.Tsuda，一个紫色的顶级品种，在阳光/UV-A光下的色素累积，可以参与并增加CHS的表达（伴随CHS家族基因的守恒的探针）和其他基因也涉及了花青素上午合成的调控( Zhouet al., 2007 )，成为了一个方便研究的系统。为了阐明CHS家族基因的具体表达和潜在的TFs和调控因素在花青素生物合成和光反应中有涉及，我们隔离了六个芸薹属植物的基因（BrCHS1-BrCHS6），同源的拟南芥CHS（AtCHS），从红色的萝卜品种Tsuda和它们共同的因子和表达模式。我们的分析表明BrCHS1，BrCHS4和BrCHS5在类黄酮化合物和UV-A光反应不同的表达等级有多余的作用。

对芸薹中的BrCHS家族基因进行隔离和序列分析——印记杂交分析对守恒的区域使用了一个BrCHS探针，显示在Tsuda萝卜中有超过六种的CHS基因（图1）。在Genebank数据库中使用序列，芸薹属的数据库和芫菁的数据( Zhou et al., 2007 )，我们隔离了cDNA和芫菁基因的六个BrCHS片段，用PCR，RT-PCR和5rsquo;和3rsquo;RACE。数据库中六个CHS基因的核苷酸序列相似性从53.4%到90.4%不等。一个关于这六个CHS基因的系统进程通过使用NJ-plot基于编码区的核苷酸序列被建立。这些CHS基因被分为两组：第一组包含了BrCHS2，-3和-6，第二组包括了BrCHS1，-4和-5（图1B）4个CHS特定的保守区域（I-IV）和21个保守氨基酸残基被分为活性位点、催化残基、CoA结合部位和其他高度保守的残基( Seshimeet al., 2005 )被确定（图1C）。所有六个CHS基因所含的两个外显子和一个内含子，是CHS基因的典型特征（图2）。花青素含量、BrCHS基因家族的表达和其他生物合成基因的差别在于——阳光照射下花青素在上皮的积累，肿胀下胚轴的部分着色，而没有明显的花青素着色在叶上或者在阳光保护下，肿胀的下胚轴下没有着色。然而，在UV-A或者蓝光的处理下花青素的含量会增加，并且UV-A对花青素的影响要高于蓝光（图3A）。在对这六种CHS基因分析下，BrCHS1，-4和-5增加了着色表皮的表达而且改进了UV-A的照射，而其它三中BrCHS基因则对光反应没有影响。尤其是，BrCHS5在着色表皮中的表达，大约能达到非着色表皮的140倍。在蓝光下，CHS1，-4和-5的表现则轻微增加，但是这个水平远低于UV-A的照射。尽管BrCHS5的表达要高于BrCHS1和-4，但是BrCHS1，-4和-5在蓝光/UV-A照射下，在着色表皮和叶中的表达的趋势总是相似的（图3B）。三种花青素生物合成基因，F3H、DFR和ANS，在mRNA水平上，也和生物合成以及表皮和下胚轴肿胀的花青素的光照射密切相关。F3H和ANS也在叶片中表达，但DFR不表达（图3C）。烟草植物的转化是利用了pCHS-GUS融合基因和GUS的活动——BrCHS1和BrCHS3的上游区（从起始密码子开始的1908nt和2143nt，分别地）被插入到Pcambia1301质粒，包含了一个GUS基因，在它的T-DNA内伴随一个内含子，为烟草植物的后续转化。转录由PCR（在线附录S6）检查。一些转基因植物包含了GUS基因和BrCHS1和-3启动子区域被鉴定。当转基因植物中的叶子和花为了GUS活性被组织化学地检验，蓝色出现在柱头和启动子转化的植物BrCHS1带色素的花瓣，然而只有弱小的蓝色斑点出现在叶子的边缘和花药上（图4）。然而，GUS表达并没有在BrCHS3启动子转录植物中的任何花器官和营养组织中被观察到，除了叶脉。转基因植物蕴藏的Pcambia1301质粒在所有的测试器官中都有GUS活性，在未被转录的，野生型植物中，任何组织都没有被GUS染色（图4）。

CHS是三型聚合酶家族中的一员，并且催化从p-coumaroyl-CoA中类黄酮前体柚苷配基查耳酮的合成( Rahman et al., 2012 )。基于前人报道和数据库中的序列，从芫菁中获得了六个CHS基因家族。

在大多数双子叶植物中，家族中6-12个查耳酮合成酶成员，例如在杨树中( Tsai et al., 2006 )，大豆中( Tuteja et al., 2004 )，角堇中( Farzad et al., 2005 )和矮牵牛花中( Koes et al., 1989b )。先前我们报道了CHS在萝卜下胚轴中的表达是被UV-A诱导的( Xu et al., 2006 ; Zhou et al., 2007 )。然而，在萝卜色素表皮上CHS表达水平的增加不能归因于CHS基因家族中的一个特定的成员，因为用于RNA凝胶印记的探针是被设计用于CHS mRNA的保守区域的。这六个BrCHS基因被分为两个亚组不仅是基于DNA相似序列，而且基于它们的表达谱。一个小组（亚组1）在除了叶脉以外的所有器官分析中起到一个低表达，并且它们的表达不受光的的诱导。另一个小组（亚组2）在下胚轴的色素表皮中表现出一个高的表达，并且这个表达受到UV-A的诱导。除了组2里的CHS基因，其它花青素生物合成基因，F3H，DFR和ANS也有同样的表达趋势。组2中BrCHS1（pCHS1）的启动子区域可以控制烟草植物中色素花瓣的GUS基因的表达。相比之下，组1中BrCHS3的启动子（pCHS3）致使了叶的主脉中GUS弱表达。这些结果证实了组2中的CHS和花青素生物合成途径有关。

BrCHS1，-4和-5的启动子区域被发现含有保守元件chs单位1或者保守元件（LRE），包含了ACE元件（CACGT），PRE元件（CATCTG）和MRE元件（ACCTACC）。相比之下，这样的基序不会在BrCHS2，-3和-6中被发现。这些元件在BrCHS1，-4和-5的启动子中可能决定了它们的转录水平。在白芥子中，保守元件chs单元1能足够调节CHS的光线反应( Rocholl et al., 1994 )和类黄酮特定组织的生产( Hartmann et al., 2005 )。豆（菜豆）中CHS15的G-box（ACE）和H-box（MRE）在转录调控中扮演了一个活泼重要的角色( Arias et al., 1993 )。大豆( Faktor et al., 1996 )和矮牵牛( van der Meer et al., 1990 )中CHS启动子的相应区域也都负责组织特异性活动。

在拟南芥中，MYB因子（PAP1和PAP2）和bHLH因子(EGL3 (Enhancer of Glabra3), GL3 (Glabra3),and TT8)，那些通过一个持续表达的WD40蛋白（Transparent Testa Glabra1, TTG1）构成一个复合体( Lepiniec et al., 2006 )，被证明了调节花青素的生物合成( Zuluaga et al., 2008 )。我们的单杂交酵母分析显示BrCHS1，-4和-5的chs单元1元件区域可以和BrHY5，BrTT8和BrPAP1蛋白相互作用，表明主题1是BrHY5，BrTT8和BrPAP1的结合部位。类似在拟南芥中的MYB-bHLH-WD40（MBW）复合体，BrTT8和BrPAP1可能和WD40 (unknown in B. rapa turnip)构成去捆绑chs单元1主题，表明了花青素生物合成BrCHS1，-4和-5的光诱导表达是通过BrTT8和BrPAP1控制的。然而，BrHY5可能是光反应的正调节蛋白，可以直接地捆绑主题1和BrCHS1，-4和-5的调节表达，尽管一个结合位点的存在并不意味着它总是在发育和不同器官中被占用。CHS表达的调节是一个复杂的调控网络，受到不同内源性和环境因素的调控( Tuteja et al., 2004 )。

在芫菁（AA,2n=20）的进化过程中，CHS基因家族分化成两组。三个组2的CHS基因家族成员被UV-A光诱导并且在色素表皮中被表达。BrCHS1，-4和-5在表皮色素，叶子和蓝光或UV-A光的照射下的表达总是遵循相似的趋势。此外，它们在它们的启动子中被解除了cis元件。一个chs单元1，由ACE（G-box），MRE和RRE组成，在BrCHS1，-4和-5的启动子中被发现。CHS基因家族中启动子的不同元件可以负责组织特异性和芫菁萝卜中CHS的UV/蓝光诱导表达。因此，BrCHS1，-4和-5可能在UV-A诱导花青素生物合成和芫菁的表皮着色中扮演一个多余的角色。对于光诱导花青素的生物合成机制，更进一步的研究以获得更高的见解是必须的。

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