拟南芥中卡拉内酯被MAX1转化为卡拉内酯酸，其甲酯可直接与AtD14相互作用外文翻译资料

 2023-03-28 11:46:09

拟南芥中的卡内酯被MAX1转化为卡内酯酸

其甲酯在体外可以与AtD14直接相互作用

作者： Satoko Abea,1, Aika Sadob,1, Kai Tanakac,1, Takaya Kisugic, Kei Asamic, Saeko Otac,Hyun Il Kimd, Kaori Yoneyamae,Xiaonan Xiea,d,e, Toshiyuki Ohnishif,g, Yoshiya Setoc, Shinjiro Yamaguchic,2,Kohki Akiyamab,2, Koichi Yoneyamaa,d,e,and Takahito Nomuraa,d,e,2

单位：a 农业研究生院生物生产科学系 b 大阪府立大学研究生院生命与环境科学研究科应用生命科学系，堺，大阪 599-8531，日本；c 东北大学生命科学研究科生物分子科学系，日本仙台 980-8577；d 东京农工大学农学联合研究生院生物生产科学系，日本东京府中183-8509；f 农学研究生院应用生物化学系e 宇都宫大学生物科学研究与教育中心生物功能分子分析部，宇都宫 321-8505，日本；g 静冈大学绿色科学技术研究所，日本静冈 422-8529

关键词： 独脚金内酯； 生物合成； 细胞色素P450； 拟南芥； 米饭

摘要：独脚金内酯 (SLs) 能够刺激根系寄生植物的种子萌发并诱导根际丛枝菌根的菌丝分枝。此外，它们已被归类为抑制枝条分枝所必需的一类新植物激素到目前为止，已经证明SLs是由类胡萝卜素通过生物合成前体carlactone (CL)生成的，这是由DWARF27 (D27)酶和两个类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD7和CCD8连续反应产生的。 我们先前在拟南芥的多腋生生长1(max1) 突变体中发现了CL 的极端积累，该突变体由于SL缺乏而显示出侧花序的增加，这表明CL 可能是细胞色素P450 单加氧酶MAX1 (CYP711A1) 的底物。为了阐明 MAX1 在 SL 生物合成中的酶促功能，我们将 CL 与在酵母微粒体中表达的重组 MAX1 蛋白一起进行孵育。MAX1催化CL的C-19连续氧化，将C-19甲基转化为羧酸，9-脱甲基-9-羧基-CL[称为carlactonoic acid (CLA)]。我们还利用LC-MS/MS鉴定了拟南芥中内源CLA及其甲酯(MeCLA)。尽管外源应用CLA或MeCLA抑制max1突变体侧花序的生长，但MeCLA(而非CLA)能与Arabi-dopsis thaliana DWARF14 (AtD14)蛋白相互作用，这是一种假设的SL受体，由差异扫描荧光法和水解活性测试表明。这些结果表明，除了已知的SLs外，meclaa也具有抑制拟南芥枝条分枝的生物活性。

独脚金内酯 (SLs) 是植物根系分泌的一种化感物质可刺激根寄生植物 Striga spp、Orobanche spp. 和 Phelipanche spp. 的种子萌发 (1)。生物营养性丛枝菌根 (AM) 真菌的菌丝分枝也由寄主根附近的 SL 诱导，以确保与寄主植物共生 (2)。 SLs 不仅是根际宿主的识别信号，而且在产生 SL 的植物本身中也发挥着重要作用。自20世纪90年代中期以来，在分析了增加枝条分枝、豌豆(Pisum satium)分枝(rms)、矮牵牛(petunia hybrida)顶端显性(dad)下降、拟南芥腋生生长(max)，矮秆(d)和高分蘖矮秆(3-6)的突变体后，人们提出了抑制植物枝条分枝过程中存在新的激素样信号。最近，这些突变体已被鉴定为 SL 缺陷或不敏感的突变体，这为 SL 作为枝条抑制激素发挥作用提供了决定性的证据(7, 8)。此外，对这些突变体的进一步表征表明，SLs 影响根系生长和发育、叶片形状和衰老、节间伸长、次生生长以及干旱和盐分胁迫反应 (9-11)。尽管SLs在植物生长发育和根际中发挥着重要作用，但SLs的生物合成途径尚未完全阐明。天然 SL 由通过烯醇醚桥连接到丁烯内酯基团（D 环）的三环内酯（ABC环）组成。5-脱氧十三醇 (5DS)和 ent-2-epi-5-deoxystrigol [4-脱氧苯酚(4DO);图1] 被认为是其他天然 SL 的前体，它们在 A 环上具有甲基，在 A/B 环上具有羟基或乙酰氧基 (1, 12)。因为 CCD7 (MAX3/RMS5/HTD1) 和 CCD8 (MAX4/RMS1/DAD1/D10) 基因的突变都编码类胡萝卜素裂解双加氧酶，导致 SL 缺乏 (7,8)，人们认为 SLs由这些酶从类胡萝卜素合成。最近，已经证明含铁蛋白 D27在体外催化全反式-beta;-胡萝卜素的 C-9 异构化以产生 9-顺式 beta;-胡萝卜素 (13) (图 1)。产物 9-cis-beta;-胡萝卜素是 CCD7 产生 9-cis-beta;-apo-10-胡萝卜素的底物，该裂解产物随后被 CCD8 催化产生名为 carlactone (CL) 的 SL 前体 (13 ）（图1）。

  1. 研究意义

独脚金内酯 (SLs) 是抑制枝条分枝的植物激素，分别是对根部寄生植物和丛枝菌根真菌的寄生和共生信号。因此，控制 SL 水平可能会提高作物的产量。为了实现这一目标，必须充分了解SLs的生物合成途径。 SLs 是由一种前体生物合成的，称为 卡内酯 (CL)，它来源于类胡萝卜素。然而，尚未阐明 CL 的下游途径。在这项研究中，我们表明 CL 被阿拉伯 dopsis MAX1 转化为羧化代谢物，命名为碳酸内酯，其酶促功能未知，并且其甲酯具有与 SL 受体相互作用的能力并抑制拟南芥的枝条分枝。

最近，我们报道了从水稻和拟南芥中检测到 CL，外源 CL 在水稻中转化为SL，证明 CL 是 SL 的内源前体 (14)。由于 CL 包含 A 和 D 环以及烯醇醚桥，但缺少 B 和 C 环，因此在植物中将 CL 转化为 5DS 和 4DO 需要额外的生物合成步骤。催化这些反应的最可能的酶是 MAX1 (CYP711A1)，一种细胞色素 P450单加氧酶 (5)。在拟南芥的相互嫁接实验中，当嫁接到 max1 砧木时，max4 (ccd8)突变体接穗中的超分枝表型被恢复为 WT 枝条分枝模式，而 max4 砧木无法将WT 枝条分枝表型恢复为 max1 接穗 (5)。这些结果表明 MAX1 能够作用 CCD8的下游通路以产生用于芽分支抑制的移动信号。最近，据报道 CL 无法通过外源应用挽救 max1 表型 (15)，并且我们发现 CL 在 max1 突变体中的极端积累(14)。因此，CL 最有可能成为 MAX1 的底物。在本研究中，为了阐明 MAX1 在 SL生物合成中的酶促功能，我们使用在酵母微粒体中表达的重组 MAX1 蛋白进行了CL 的体外转化。然后，我们通过检测和鉴定拟南芥和水稻植物中的 CL 代谢物来检查 CL 是否在体内以类似的方式代谢。此外，为了研究 CL 衍生物对枝条分枝抑制的作用，我们检测了它们的生物活性以及与拟南芥 DWARF14 (AtD14)（一种假定的 SL 受体）的相互作用。

图 1. 类胡萝卜素 SL 的拟生物合成途径。

D27、CCD7 和 CCD8 酶将 beta;-胡萝卜素转化为 CL 先前已通过体外试验证实 (13)。本研究显示了 MAX1 从 CL 到 CLA 的转化以及拟南芥中 CLA 和 MeCLA 的存在。

  1. 研究方法及结果

2.1 MAX1 C-19 氧化 CL

拟南芥 MAX1 蛋白在酵母 WAT11 菌株中表达，该菌株是为共表达拟南芥 NADPH-P450 还原酶 (ATR1) 而产生的 (16)。通过表达 MAX1 的 WAT11 制备的微粒体（MAX1 微粒体）显示出 P450 特异性还原的一氧化碳差异光谱，在 450 nm处具有吸收峰，但用空载体转化的细胞的对照微粒体没有（图 S1），表明重组MAX1 蛋白是一种活性 P450 酶。可用 MAX1 酶候选底物的 C-11 外消旋(rac)CL与 MAX1 和对照微粒体一起温育。 P450 酶是单加氧酶，可在动物、植物和微生物的生物合成和代谢途径中催化极其多样化的反应，并且通常通过分子氧的还原活化来介导氧原子插入底物 (17)。因为 CL 在 C-19 位的氧化需要在 CL 的生物合成途径中形成 C 环的内酯 (13)，所以 19-羟基-CL 是 MAX1 CL 代谢物最可能的候选物（图 1）。因此，我们合成了 rac-19-羟基-CL（图 S2）并使用LC-MS/MS 的电喷雾电离（ESI）阳性模式将其与 MAX1 的代谢物进行比较，以获得保留时间和 MS 碎片。在 m/z 319 处的 [M H] 中的 H2O 损失产生的前体离子 [M H–H2O] 在 m/z 319 处向子离子的跃迁在 MAX1 微粒体的提取物中检测到rac-CL，以及在真实的 rac 19-羟基-CL 样品中，但不是在对照的微粒体中，使用选择的反应监测 (SRM)（图 S3）。代谢物的产物离子和保留时间与真正的 rac-19-羟基-CL 相同（图 2A）。

2.2 MAX1 催化连续三步氧化

众所周知，在植物次生代谢物的生物合成途径中，羧化通常通过由 P450 催化的连续三步氧化反应进行 (18, 19)。为了研究 MAX1 是否通过催化三步氧化将 CL 的 C-19 甲基转化为羧酸（图 1），我们合成了 rac-9-去甲基-9-羧基-CL [称为 碳酸内酯 (CLA)] (图 S4A) 并使用它作为标准来追踪与 rac CL 孵育的 MAX1 微粒体提取物中的化合物。通过 ESI- 在 MAX1 微粒体提取物中检测到与假分子离子 [M-H]- 对应的 m/z 331 处不同离子到正宗 rac-CLA 产物离子的跃迁，但在对照提取物中未检测到。 LC-MS/MS 的负模式（图 S5A）。代谢物的产物离子和保留时间与真正的 rac-CLA 相同（图 2B）。当 rac-19-羟基-CL 作为底物与 MAX1 微粒体一起孵育时，也检测到 CLA（图 S5B）。然而，由于其不稳定性，我们无法合成真正的 19-氧代-CL，因此无法证实 19-氧代-CL（19-羟基-CL 和 CLA 之间的推定中间体（图 1））的发生。当 rac-CLA 与重组微粒体一起孵育时，没有检测到诸如已知 SL 的代谢物。

2.3 MAX1 首选 11R-CL 至 11S-CL 作为基板

当使用 [1-13CH3]rac-通过 LC-MS/MS 对产物 CLA 进行定量时，rac-CL 和 rac-19-羟基-CL 的表观解离常数 (Km) 分别为 413 plusmn; 65 和 960 plusmn; 87 nM。CLA 作为内标（图 S5C）。 rac-CL 和 rac-19-羟基-CL 的表观催化常数 (kcat)分别为 0.063 plusmn; 0.003 和 0.114 plusmn; 0.003 min-1 (图 S5C)。 CL 的 C-11 对应于 SL 的 C-2（图 1）。 CL 中 C-11 的构型被认为对于确定 SL 的立体化学很重要，因为所有天然 SL 的 C-2 构型是 (R) (1)。立体异构体 11R-CL 和11S-CL (14) 与 MAX1 微粒体在 500 nM 下孵育，产物 19-羟基-CL 和 CLA 使用它们的 [1-13CH3] 标记的 rac 内标进行定量。 19-羟基-CL 和 CLA（均假定为 11R）由 11R-CL 在 0.101 plusmn; 0.005 和 0.025 plusmn; 0.002 min-1 分别产生，而没有 19-羟基-CL 和少量 CLA（假设从 11S-CL (图 3) 中检测到 11S)。

2.4 在拟南芥中检测到内源性CLA并将外源性CL转化为CLA

为了确认植物中 CLA 的存在，我们分析了拟南芥植物中的内源 CLA。从 WT的根中提取 CLA 馏分，水培法生长的拟南芥 max1、max4、atd14 和 max2 突变体，并通过 LC-MS/MS 进行分析。产物离子的全扫描光谱和保留时间证实了内源性 CLA 在 WT 提取物中的存在，以及在 SL 感知成分中存在缺陷的 atd14和 max2 突变体的存在 (20) (图 4A)。相比之下，在 max1 和 max4 突变体的根提取物中，CLA 的内源含量低于检测限。使用 [1-13CH3]rac-CLA 作为内标对内源性 CLA 进行定量。 WT 中 CLA 含量为 32.5 plusmn; 5.2 pg/g 鲜重，atd14 和 max2突变体中的含量分别增加至 12 倍和 20 倍（图 4B）。在这些实验中，我们无法在拟南芥根的组织和分泌物中检测到已知的 SL。为了进一步研究 CLA 是否也由植物中的 CL 产生，将 max4 突变体水培生长并与添加到培养基中的[1-13CH3] 11R-CL 一起孵育。结果，通过LC-MS / MS分析在max4根中检测到[13C1]标记的CLA（图S6A）。然而，当将 max1m

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