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基因表达谱鉴定临床相关的前列腺癌亚型
Jacques Lapointe,李春德,John P. Higgins, Matt van de Rijn, Eric Bair, Kelli Montgomery, Michelle Ferrari, Lars Egevad, Walter Rayford, Ulf Bergerheim, Peter Ekman, Angelo M. DeMarzo, Robert Tibshirani, David Botstein, Patrick O. Brown, James D. Brooks, and Jonathan R. Pollack.
病理学，生物化学，泌尿学，统计学，卫生研究与政策，遗传学系和霍华德休斯医学研究所，斯坦福大学，斯坦福，加利福尼亚州94305；卡罗林斯卡医学院外科学系，SE-171 77瑞典斯德哥尔摩；路易斯安那州立大学健康科学中心泌尿外科，新奥尔良，LA 70112；林雪平大学医院生物医学和外科系泌尿外科，581 83瑞典林雪平和约翰霍普金斯大学病理学系，巴尔的摩，MD 21205。
由位于纽约的纽约Memorial Sloan-Kettering癌症中心的Harold E. Varmus编辑，并于2003年11月17日批准（2003年7月9日收到审查）。
前列腺癌是癌症死亡的主要原因，表现出从相对惰性到侵袭性转移性疾病的广泛临床行为。为了探索这种临床异质性潜在的分子变异，我们使用含有约26,000个基因的cDNA微阵列，在62个原发性前列腺肿瘤，以及41个正常前列腺标本和9个淋巴结转移中提供基因表达。无监督的层次聚类很容易将肿瘤样本从正常样本中区分出来，并且基于不同的基因表达模式进一步识别前列腺肿瘤的三个亚类。高级和晚期肿瘤以及与复发相关的肿瘤在三种亚型中的两种中不成比例地表现，其中一种亚型也包括大多数淋巴结转移。为了进一步表征肿瘤亚型的临床相关性，我们通过在代表225个前列腺肿瘤的独立组的组织微阵列上使用免疫组织化学来评估作为替代标志物的两个在肿瘤亚组中差异表达的基因。MUC1阳性染色是一种在具有“临床”病理特征的亚组中高表达的基因，与复发风险升高有关（P=0.003），而一种在另一亚组中高表达的基因AZGP1的强染色与复发风险降低相关（P=0.0008）。在多变量分析中，MUC1和AZGP1染色是肿瘤复发的强预测因子，与肿瘤分级、分期和术前前列腺特异性抗原水平无关。我们的研究结果表明，前列腺肿瘤可根据其基因表达模式进行有用的分类，这些肿瘤亚型可为改善预后和治疗分层提供依据。
在世界范围内，前列腺癌是第三大常见癌症，并且是男性中6％的癌症死亡原因[1]。其发病率和死亡率在世界不同地区有所不同，在西方国家最高[2]。在美国，它是男性癌症死亡的最常见诊断和第二大原因[3]。尽管死亡率很高，前列腺癌仍然是一种惰性疾病，患者可以保持无症状多年。血清前列腺特异性抗原（PSA）筛查的广泛使用已经导致在年轻男性中鉴定出越来越多的无症状低阶段肿瘤[4,5]。一个重要的临床问题已经成为是否以及如何积极地进行治疗这种局限性前列腺癌患者。
目前，诊断时的预后和治疗分层基于临床分期、活检Gleason分级（肿瘤分化的量度）和血清PSA水平。在根治性前列腺切除术治疗的病例中，可以通过使用病理分期和分级来改善预后。然而，这些预后指标不能准确预测个体患者的临床结果。需要改进标记物以确定哪些患者可以从更积极的治疗中受益，以及哪些患者可以免于不必要的和可能有害的干预。
观察到的前列腺癌的临床异质性可能反映了肿瘤中潜在的分子异质性，尽管在光学显微镜下很大程度上是不可见的，但可以通过使用DNA微阵列分析基因表达来捕获。实际上，微阵列分析研究已经确定了白血病[6,7]，淋巴瘤[8]，乳腺癌[9,10]和肺癌[11-13]中临床相关的基因表达亚型。虽然前列腺癌的DNA微阵列研究已经确定了与非肿瘤样本[14-18]相比在肿瘤中差异表达的基因，以及其表达与肿瘤分级、转移和疾病复发相关的基因[14,17,19,20]，迄今为止，基于基因表达的肿瘤亚型尚未被认识到。
在这里，我们报告基于cDNA微阵列的前列腺癌研究，导致生物学和临床相关基因表达肿瘤亚型的鉴定。此外，我们证明两个基因的蛋白质表达水平，作为肿瘤亚型的替代标志物，是肿瘤复发的强预测因子，与已知的危险因素无关。我们的研究结果支持前列腺癌中存在不同的基因表达亚型，以及它们在疾病诊断和治疗中的潜在用途。
材料和方法
基因表达谱。新鲜冷冻的前列腺手术标本来自斯坦福大学、卡罗林斯卡学院和约翰霍普金斯大学，并获得相关中心的机构审查委员会批准（参见支持说明1，该出版物作为PNAS网站上的支持信息发布）。总之，我们选择研究62个原发性前列腺肿瘤（61个腺癌和1个腺样囊性肿瘤），41个匹配的正常前列腺组织（来自前列腺的非癌区域）和9个不匹配（即不同患者）的盆腔淋巴结转移。表2提供了标本的详细病理和临床数据，表2作为PNAS网站上的支持信息发布。通过使用含有26,260种不同人基因（UniGene簇）的cDNA微阵列，基因表达谱分析实际上就如所述[9]那样被执行了。支持注释2中提供了更详细的信息，包括数据选择和操作方法，支持注释2作为PNAS网站上的支持信息发布。
组织微阵列。使用组织阵列器（比彻仪器公司，Sun Prarie，WI）构建前列腺癌组织微阵列，其包括从斯坦福大学收集的诊断性根治性前列腺切除术标本中选择的225个福尔马林固定和石蜡包埋的原发性前列腺肿瘤病例的独立组，机构审查委员会批准。每个病例代表重复的0.6mm肿瘤核心，该系列的最小临床随访时间为5年，中位随访时间为8年。针对MUC1的初级抗体（SC-7313，圣克鲁斯生物技术公司）和AZGP1（SC11242，圣克鲁斯生物技术公司）用于免疫组织化学染色。更多详细信息可在支持说明3中找到，该说明在PNAS网站上作为支持信息发布。
结果
前列腺肿瘤亚型的鉴定。为了调查前列腺肿瘤的分子变异，我们通过使用含有26,260种不同基因的cDNA微阵列分析了112种前列腺组织中的基因表达，包括62种原发性肿瘤，41种匹配的正常前列腺组织和9种不匹配的淋巴结转移（参见材料和方法）。为了探索样本之间的关系和基因表达的基本特征，我们应用了一种无监督的双向分层聚类方法，使用了5,153个cDNA，其表达在样本中变化最大（图1a）。总体而言，样本分为两个主要群集（图1b），一个代表肿瘤，另一个，除了两个例外，代表正常的前列腺样本。其中一个例外是腺样囊性肿瘤（样本PT153），它是一种罕见的肿瘤，具有基底上皮细胞的特征[21]，存在于正常前列腺中但在前列腺腺癌中不存在。另一个例外（PT110）可能反映了异常高水平的正常组织污染。尽管与正常前列腺样本相比，肿瘤标本通常具有更高的上皮细胞分数，但肿瘤正常基因表达差异不仅仅反映了不同的上皮细胞含量（参见支持说明4，其作为PNAS网站上的支持信息发布）。基因表达“特征”代表在前列腺腺癌中高度表达的基因（图1k），包括AMACR和TACSTD1，两者均有先前描述[18,22,23]，以及肿瘤坏死因子受体超家族、成员21（TNFRSF21）、高尔基体磷蛋白2（GOLPH2）、net-6和乙酰辅酶A羧化酶（ACACA），后者与-甲基酰基-CoA消旋酶（AMACR）一样，参与脂肪酸代谢。这些基因以及该特征内的其他基因可以为改善诊断或治疗提供基础。较大的基因簇在肿瘤中的表达始终低于在正常前列腺样品中的表达（部分显示在图1d中）。
值得注意的是，无监督聚类还根据不同的基因表达模式将肿瘤样本分为三个主要亚组（图1b）。这些亚组通过使用各种预聚类数据过滤和样本选择标准进行鉴定（图4，作为PNAS网站上的支持信息发布），并且主成分分析也证明了这一点（图5，作为PNAS网站上的支持信息发布），意味着它们代表强大的类（参见支持说明5和表3，它们作为PNAS网站上的支持信息发布）。亚型III包括原发性肿瘤以及大多数淋巴结转移，并且相关的基因表达特征（图1g-i）包括与细胞外基质相关的基因（例如，COL1A1，COL1A2，CSPG2，SPARC；图1g），细胞增殖（如TOP2A，E2F1，CDC2，CDC25C；图1h），以及能量生产反映的代谢活动增加（如ATP5D，DCI，DECR2；图1i）和蛋白质合成（例如，RPL13，RPS15，RPS9）。亚型I肿瘤与基因表达的两个特征相关（图1c和f），其中一个（图1f）包括也在正常前列腺上皮中表达的基因，例如AZGP1[24]和ARSDR1[25]。亚型II代表最大的肿瘤亚类，并且除了具有特征性基因表达特征（图1e）之外，还与肿瘤亚型III共享表达特征（图1j和l）。
肿瘤亚型与不同的临床病理学特征相关。如上所述，亚组III内的原发性肿瘤具有无法匹配的淋巴结转移的表达特征。为了进一步了解新分子亚型的生物学和临床相关性，我们检查了原发性肿瘤中临床病理参数的分布（图1b）。肿瘤亚组II和III中高级和晚期肿瘤的代表性更高（P=0.04，检验；表4，作为PNAS网站上的支持信息发布）。在我们的数据集中发现与早期复发相关的7个肿瘤仅存在于亚组II和III中。与这些观察结果一致，使用微阵列显著性分析（SAM）方法的监督分析（参考文献26；参见支持注释2）确定了其表达与高级、晚期或早期肿瘤复发相关的基因组（图1m和2）；这些基因主要位于表征肿瘤亚型II和/或III的基因表达特征中（图1e，g，j和1；也参见支持说明6和表5，它们作为PNAS网站上的支持信息发布）。
总之，我们鉴定了41个与高级相关的基因（图2a）和11个与晚期相关的基因（图2b），错误发现率（FDR）分别为2％和8％。在与高级相关的基因中，Singh等人[17]报道了COL1A2，SPARC，ABCA5和BGN与肿瘤分级相关；然而，同一项研究未发现与肿瘤分期相关的基因。我们还确定了4个阳性基因和19个与早期复发负相关的基因（图2c），FDR为16％；相对较高的FDR可能归因于短期临床随访。虽然这个基因组与Singh等[17]报道的5个结果预测基因之间没有重叠，但我们的23个与结果相关的基因组准确地预测了他们研究中患者的复发情况（图6，作为PNAS网站上的支持信息发布）。
肿瘤亚型的替代标志物预测复发。为了进一步表征肿瘤亚型的临床相关性，我们通过在组织微阵列上使用免疫组织化学评估了两种在肿瘤亚型中差异表达的基因的替代标记物，所述组织微阵列是包含225个原发性前列腺肿瘤的独立集，最小临床随访5年，并且中位随访8年。基于它们在亚型之间的差异表达和特异性抗体的可用性来选择这两个基因。编码粘蛋白1跨膜蛋白的MUC1存在于基因表达特征中，其表征肿瘤亚型II和III（图1j），两者都与更多的“侵袭性”—临床病理学特征相关。通过组织微阵列上的免疫组织化学染色确定的MUC1蛋白表达在肿瘤中是可变的（图3a）；在Kaplan的生存分析中，阳性MUC1染色与显著缩短的复发时间相关（P=0.003；图3c）。相反，编码锌 -2-糖蛋白的AZGP1存在于表征肿瘤亚型I的特征内（图1f），并且AZGP1的强免疫染色与显著延长的复发时间相关（P=0.0008；图3d）。通过组合MUC1和AZGP1的免疫染色数据（图3e），获得无复发存活曲线中最宽的分离，提示对预后具有附加价值。
尽管我们注意到肿瘤亚型与肿瘤分级和分期之间存在相关性，但没有发现MUC1或AZGP1蛋白表达与肿瘤分级或分期之间存在显著相关性（表6，其作为PNAS网站上的支持信息发布）。为了确定MUC1和AZGP1表达是否增加了超过已知预后因素的预后信息，我们进行了多变量比例风险分析。MUC1和AZGP1染色被发现是肿瘤复发的强预测因子[优势比分别为2.4（1.3—4.2）和0.38（0.21—0.69）；P lt;0.001]，与肿瘤Gleason分级、分期和术前血清PSA无关（表1）。
讨论
我们研究的主要目的是调查前列腺癌的分子变异，以获得对这种临床异质性疾病的潜在生物学的新见解。我们使用无监督的双向分层聚类来发现原发性前列腺肿瘤根据不同的基因表达模式分层为三个强大的亚型。此外，临床病理学特征的分布，以及这些亚型的替代免疫组织化学标记物在一组独立样品上的表现，表明这些亚型与不同的生物学和临床行为有关。
我们已将亚型I肿瘤表征为临床上最不具侵袭性的亚类。实际上，定义亚型I的两种基因表达特征之一（图1f）包括在正常前列腺中表达的基因，表明该亚组可代表更高度分化的肿瘤。我们选择AZGP1表达作为该肿瘤亚型的替代标志物，并且强免疫染色与更长的无复发存活期相关，与肿瘤分级和分期无关。先前已报道AZGP1在原发性前列腺肿瘤中表达，并且在转移中表达较少[27,28]。Hale等[28]发现与肿瘤分期和分级呈负相关，而Gagnon等[27]和我们一样，没有发现这种关联。考虑到亚群I虽然主要包括低级别肿瘤，但也包括高级别肿瘤，我们推测表达谱可以识别组织学上不明显的分化分子特征。
我们已经确定亚型III，以及亚型II，代表临床侵袭性肿瘤亚型。值得注意的是，亚型III原发性肿瘤的基因表达与不匹配淋巴结转移具有共同特征(图1g-i)。据报道，原发性前列腺肿瘤和转移癌之间存在
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资料编号：[1815]
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