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污水处理厂中应用qPCR技术识别和量化Thiothrix eikelboomii菌群对污泥膨胀进行早期监测
摘 要：本研究发现，与单独的绝对T. eikelboomii丰度指标相比，Thiothrix eikelboomii与总细菌浓度的比率（TH / TB）（％）是评估污泥膨胀对出水水质影响的更好指标。这一指标是使用属特异性Thiothrix定量PCR引物和探针组来确定的。该引物在本研究中用于监测1年期间特定的Thiothrix菌群数量变化。根据硝化 - 反硝化废水处理厂中16S rRNA基因的测序，T.eikelboomii被确定为导致污泥膨胀的主要因素。 2009年3月，4月和7月观察到的T. eikelboomii浓度峰值分别为2.32times;1010,2.64times;1010和1.84times;1010cells/ L。T.eikelboomii对总细菌数量的比率峰值在3月份被测得，为0.24％。而比率大于0.19％会导致二级处理出水中悬浮固体和生化需氧量的增加。另外，进食量与微生物比率（F/M）、缺氧选择器中的溶解氧浓度和初级流出物中的铵离子浓度这三个参数在统计学意义上与Thiothrix spp.在曝气池中的丰度有显著相关性（分别为r = 0.40，r = 0.50和r = 0.32）。当缺氧选择器中的溶解氧浓度保持低于0.12mg / L且TH / TB比率lt;0.10％时，则不会发生由T. eikelboomii引起的膨胀事件。
关键词：Thiothrix eikelboomii；021N型；污泥膨胀；缺氧选择器；活性污泥；Thiothrix eikelboomii与细菌总数比率（TH / TB）
引言
污水处理厂中的污泥膨胀经常被认为是丝状细菌的过度生长导致的（Jenkins等人，2003），其会降低二级出水的质量并给水厂运作带来困难。污泥膨胀问题已经被广泛的研究，但仍然在世界范围内一直发生。此外，污泥膨胀发生的最终结论和成功解决方案通常只适用于特定的地点或水厂。
目前，在污水处理过程中已经观察到20-30种丝状细菌形态（Bitton 2011）。然而，对于这些丝状细菌中的一些仍在进行分类学上的分类。021N型是一种众所周知的丝状细菌，世界范围内都有分布（Eikelboom 1977; Kristensen et al. 1994; Madoni et al. 2000; Richard et al. 1982），并且可以通过显微镜分为Thiothrix I和Thiothrix II两类（Eikelboom 1975）。研究表明021N型由几个Thiothrix属内的在16S rRNA基因序列上具有88.3-98.7％的相似性的菌种组成（Aruga et al. 2002; Howarthet al. 1999; Dumonceaux et al. 2006; Kanagawa et al. 2000）。因此，根据环境条件的不同，Thiothrix spp被发现可以有许多种代谢状态，包括异养，自养，混合营养或岩石自养（Aruga et al. 2002; Nielsen et al. 2000）。所以，由021N型，Thiothrix I和Thiothrix II引起的污泥膨胀通常与各种操作和环境因素有关，如低溶解氧（DO）浓度，营养缺乏，高硫化物浓度，特定工业废水或高有机负荷率（Jenkins et al. 2003; Thompson et al. 2001）。这些群体中的导致污泥膨胀的菌类也可以在未处理污水进水时引入污水处理厂（Jenkinset al. 1984; Pacheco et al. 2003）。丝状细菌如属于021N型的菌类可能导致严重的污泥膨胀，因为这些微生物产生的絮凝物具有较差的沉降特性，光学显微镜观察到它们后，在2-4天之内，可能会伴随产生较高的沉降特性污泥体积指数（SVI）（Richard et al. 1985）。一些研究报告声称021N型不能用氯控制（Madoni et al. 2000; Seka et al. 2001）。此外，有氧，缺氧或厌氧塞流选择器都经常被用来防止污泥膨胀发生（Chudoba et al. 1973; Martins et al.2004），但是仍然存在膨胀问题（Martins et al. 2004）。
大多数关于Thiothrix I，Thiothrix II和021N型引起的污泥膨胀的研究使用光学显微镜和荧光原位杂交（FISH）技术来量化它们的浓度。其中一项研究研发出021N型的引物，将这些引物与Sybr Green结合使用在实验室规模测试中可以量化这些细菌（Vervaerenet al. 2005)）。我们的研究开发了一种新的定量PCR（qPCR）引物和探针组来增强针对Thiothrix eikelboomii——在我们的研究中导致污泥膨胀的一个重要因素——的特异性。以此达到两个目的，首先调查T. eikelboomii的丰度，其次评估在一个深度污水处理厂中标准操作和物理化学参数如何对这种细菌产生影响。我们的分子发现表明细菌T. eikelboomii达到了三个峰值浓度。当DO浓度gt; 0.12 mg /l且伴随着高F / M比率时，缺氧选择器中溶解氧（DO）是导致污泥膨胀的主要因素。而DO浓度lt;0.12 mg / l且伴随高F / M比率时，T. eikelboomii仅略微增加浓度。最后我们得出结论，T.eikelboomii对总细菌（TH / TB）的比率（％）相比仅测量T. eikelboomii丰度或使用显微镜观察可以更好的预测污泥膨胀和二次出水水质。
1 材料与方法
1.1 研究地点和样品采集
废水样本从每天生产1800万加仑（MGD）迈克尔逊污水处理厂（MWRP）收集，其位于美国加利福尼亚州欧文市。 MWRP采用的工艺流程是完全硝化和部分反硝化，再加入甲醇和硝酸盐再循环以增强反硝化过程。 一级出水和二级出水的操作和理化参数如表S1所示（见补充说明材料）。 样品取自水厂四个不同的地方，包括：（1）一级出水（2）缺氧选择器混合液（3）曝气池中的混合液（4）二级出水.MWRP的样品从2009年1月27日到11月30日每周一次收集在250ml的无菌容器中。在24小时之内，样品会冰镇运输到实验室，4°C条件下冷藏直至分析。MWRP的示意图显示在图S1中（见补充材料）。
1.2 DNA提取
使用改良的珠粒打浆协议（Gedalanga和Olson，2009; Yu和Mohn，1999）。从每个样品中分出三个子样品提取基因组DNA。使用DUreg;7400分光光度计（Beckman，Orange，CA，USA）通过分光光度法在260和280nm处进行分析测量所有DNA提取物的浓度和纯度。所有纯度（A260 / A280）介于1.60和1.80之间。 用无菌高性能液相色谱（HPLC）级水（FISHER Scientific，Fairlawn，NJ，USA）稀释用于qPCR分析的环境提取物为100倍。立即将稀释和未稀释的DNA样品分别在- 80和 - 50℃条件下储存，直至使用 。
美国农业研究所（USDA，IL）提供了六种细菌菌株，包括Burkholderia cepacia（B-14858），Gordonia amarae（B-8176），Millisia brevis（B-24424），Paracoccus denitrificans（B-3785），Pseudomonas putida（B-1023）和Zoogloea ramigera（B-3642）。 所有菌株在美国农业部推荐的培养基中种植，就如Asvapathanagul等人（2012年）所描述。霍乱弧菌液菌株由加州大学欧文分校应用与环境微生物学实验室提供(Irvine, CA,USA)。 提取的Nitrosomonas europaea（ATCC 19718）DNA来自美国典型培养物保藏中心（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）。 提取Mycobacterium bovis (（ATCC19210）DNA和t Escherichia coli O157：H7（ATCC43895）菌株由食品和药物管理局：西南太平洋区域实验室（FDA：PRLSW; Irvine，CA，USA）提供。 如Gedalanga中所述培养E. coli(2010)。在DNA提取环节， 所有培养物都使用相同的提取方案。
1.3 qPCR Thiothrix spp.引物和探针开发
第一步，在Thiothrix spp.序列中确定了同源区域和16S rRNA基因部分序列的异质性。
在该步骤中，使用 GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上的基础局部比对搜索工具（NCBI/BLAST/BLASNSuite），对 T.eikelboumii（NR_024758）的16SrRNA 基因进行喷砂处理，并与其他Thiothrix 16S rRNA 基因进行比对。 这形成了5'–3' 的共有序列（Altschul et al. 1990）
第二步，比较T. eikelboomii (NR_024758)的16S rRNA 基因，并与所有其他细菌进行比对，排除未培养/环境样本序列，形成5'–3' 的共有序列，以进入与硫柳杆菌属相比具有高度差异的区域。 16S rRNA 基因（alrschul et al.1990）。引物和探针集，命名为 Thithrix16S-F、Thithrix16S-R 和 Thithrix 探针（表1），其与其他细菌属无同源性，但对所有 Thitthrix 属均具有同源性。 选择16S rRNA 基因序列。
第三步，使用 BLASTN 对16S rRNA 扩增子、 Thithrix16S-F、R 引物和 Tithrix 探针序列进行重新筛选（ALTschul et al. 1990）确定交叉反应性。 Thithrix16S-F 和 Thithrix16S-R 引物产生了115个碱基对（bp）扩增子。尽管有些属的核酸序列与大部分正向或反向引物匹配，但由于只有一个引物具有同源性，因此没有产生大小相似的扩增子或没有形成扩增子。
最后，使用计算机模拟 PCR 扩增软件进行计算机模拟检查，以验证结果（Bikandi et al.2004）。采用 Thithrix DNA 片段对 Thithrix16S-F 和 R 引物组 A 的 PCR 条件进行了优化，表明使用 Eppendorf Realplex EP（Eppendorf,Hauppauge,NY,USA）时引物的最佳退火温度为60.3℃。使用60.3℃的退火温度的MgCl2的最佳浓度为3.75mM，以每0.25增量从2至5mM测定。
1.4 PCR 和 qPCR 试验
使用 qPCR 对每种环境核酸外源基因进行重复三次扩增。 使用 Thithrix16S-F 和 R 引物扩增了 Thithrix 属的16S rRNA 基因。与 Thithrix 探针偶联，定量测定基因靶标（表1）。 环境 DNA 提取物的 qPCR 方案包括在94℃ 下保持2分钟，然后在94℃ 下变性20s，并在60.3℃ 下退火40s/循环，持续35个循环。 主混合物由3.75mM MgCl2（Takara,Tokyo,Japan）、1times; 缓冲液（Takara,Tokyo,Japan）、200nM dNTP（Takara,Tokyo,Japan）、0.75U Ampliaq DNA 聚合酶（Takara,Tokyo,Japan）、每个正向引物和反向引物（Sigma-Genosys,Win-Dands,TX,USA）的200nM、100nM 探针（生物搜索技术,Novato,CA,USA）组成，100ng/L 牛血清白蛋白（New England Biolab,Ipswich,MA,USA），用 HPLC 级水补足至最终体积20mu; L，向其中加入5mu; L 各1:100稀释 DNA 样品。 各反应中 DNA 样品模板浓度范围为1-10ng/L。 每次 qPCR 运行均伴随一个阴性对照和一个标准曲线，包括已知浓度的大肠埃希氏菌 DNA 片段。 试验的最低检测限为5.6times;104拷贝/反应。 在 Eppendorf Realplex EP（Eppendorf,Hauppauge,NY,USA）上运行了 Thithrix qPCR。 所有 qPCR 运行的效率范围为0.94-1.05，决定系数（r2）为0.996-0.999，y-间期截距为38.51–40.55，斜率为-3.212至-3.478。Thithrix PCR 运行使用相同的引物和温度循环方案，但未添加探头。
先使用表1中所述的引物和探针，然后使用来自Asvapathanagul等人（2012）的总细菌qPCR方案进行总细菌qPCR测定。在转子-基因（Qiagen，USA）上运行细菌总 qPCR。 总细菌 qPCR 试验的有效性平均值和标准偏差为0.94plusmn;0.05，R2为0.99714plusmn;0.00361，斜率为-3.5010plusmn;0.1469，y 轴截距为43.1642plusmn;2.6900。
将溶解曲线 SYBR Green I（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）以0.05倍的最终浓度添加到 Thithrix PCR 主混合物中。 使用 Eppendorf Realplex EP（Eppendorf,Hauppuge,NY）进行 SYBR 绿色反应，温度以1° 为增量从55℃ 升至99℃。
对 Thithrix16S-F 和 R 引物的115个碱基对扩增子进行了 PCR 产物分析、 PCR 产物纯化和 DNA 测序。 使用8mu; L PCR
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资料编号：[796]
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