阿扎霉素聚酮合酶中的一个迭代模块包含可开关的烯基还原酶域外文翻译资料

 2022-01-27 22:39:13

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阿扎霉素聚酮合酶中的一个迭代模块包含可开关的烯基还原酶域

Wei Xu , Guifa Zhai , Yuanzhen Liu, Yuan Li, Yanrong Shi, Kui Hong, Hui Hong,Peter F. Leadlay, Zixin Deng, and Yuhui Sun*

摘要：通过对参与红树林链霉菌属Streptomyces sp.211726体内大环内酯类阿扎霉素F的生物合成过程的I型聚酮合酶（polyketide Synthase，PKS）进行详细分析，已经发现只有19个延伸模块被用来实现了20次聚酮链延长。分析特异性失活延伸模块1中脱水酶域得到的聚酮合酶突变体产物，发现这个模块催化两次连续的碳链延伸，且该模块两次连续伸长结果不同。引人注目的是，这个模块的烯基还原酶域显然能在两次过程中分别被“关闭”和“开启”：它只在这两个循环的第二次延伸中起作用。这个新奇的机制扩大了我们对聚酮合酶线性催化的认知，而且也许能解释其他模块聚酮合酶系统中明显的非共线性现象。

关键词：抗生素 生物合成 烯基还原酶 迭代模块 大环内酯聚酮合酶

模块化I型聚酮合酶（polyketide Synthase，PKS）催化大量具有抗菌、抗真菌、驱虫、抗肿瘤以及免疫抑制药理活性相关天然产物的生物的合成[1–4] 。这些庞大的多模块酶组成了一条高效的流水线，用（烷基）丙二酰基辅酶酯(alkyl)malonyl-CoA esters作为延伸单元的本源生产聚酮化合物骨架。每个模块包含一个酮基合酶（beta;-ketoacyl synthase，KS），用于把进入单元压缩到延伸的聚酮链上；一个酰基转移酶（acyltransferase，AT），用来加载延伸单元；一个酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP），用来将延伸的碳链保留在PKS上。除了这些固有的酶域，酮基还原酶（b-ketoreductase，KR）、脱水酶（dehydratase，DH）和烯基还原酶（enoylreductase，ER）可选择性的实现不同程度的还原。最后，这个全长链被释放，例如通过一个环化酶/硫酯酶实现。总的来说，这些模块和酶域的组织与最初的聚酮产物的化学结构完全一致。这种共线属性使模块PKS成为了合理的生物工程中的有吸引力的课题，以生产新型生物活性化合物，并且促进了新型生物合成途径的基因组序列的挖掘。然而，关于这个线性规则的例外现象逐渐引起了人们的兴趣。一个早期的例子是苦霉素聚酮合酶，通过PKS模块选择性的“跳过”现象，产生12元和14元的大环内酯。在其他的例子里面，一个单独的模块催化两轮或更多连续的（相同的）聚酮碳骨架延伸，要么得到突变的产物，或者作为正常生物合成方式的一部分。这些例外预示着提高我们对模块PKSs的自然演变的理解，并且可能为有效的设计这些系统提供经验。

这个36元大环抗真菌药物阿扎霉素（AZLs）是Streptomyces sp.211726的主要产物，这种菌已经被从红树林根际土壤中分离出来。这些化合物有广谱的抗菌活性，以及抑制人类结肠肿瘤细胞株的毒性。阿扎霉素F5a及其衍生物也显示出耐甲氧西林金黄色葡糖球菌的活性。阿扎霉素F3a，F4a和F5a也能从Streptomyces malaysiensis DSM 4137中产生，并且先前已经提出了一个模型，其中第一个延伸单元同时催化第一轮和第二轮聚酮链延伸的循环，基于发现当这个基因簇被转移到异源菌株上时，也产生了阿扎霉素。这个现象排除了在已知S.malaysiensis基因组其他地方有额外的PKS参与编码。对Streptomyces sp.211726进行全基因组测序，发现了一个在大小和排列方面与DSM 4137 阿扎霉素基因簇高度相似的基因簇。它有完全相同的模块和酶域的排列以及侧翼辅助基因跨越大约130kb的DNA区域（如图1和表S1），并且敲除这整个区域（如图S1）会导致阿扎霉素产物的完全丢失。和以前一样，这种非共线性很容易局限于模块1和模块2（如图2和图S2）。

图1.a）阿扎霉素F生物合成基因簇的组织。PKS编码基因以灰色突出表明。b）阿扎霉素F类似物的结构。粗体表明由聚酮合酶的每个酰基转移酶域掺入的丙二酰基和甲基丙二酰基延伸单元。化合物4~12是次要组分。

图2.阿扎霉素聚酮合酶装配线与产品结构之间的非共线性。a）从AZL生物合成基因簇的核苷酸序列和预测的结构域组织推导出AZL（显示胍基取代的链）化学结构。 b）根据规范的共线性规则，基于AZL的实际结构对PKS组织进行生物信息学预测。

为了验证延伸模块1迭代性的发挥作用并且提供缺失的用于调控第二轮延伸的完全还原模块的作用这个假设，在活体内对DH1酶域的活性位点进行点突变失活，将必须的组氨酸残基变成丙氨酸（如图S3）。液相色谱电喷雾电离高分辨质谱（Liquid chromatography electrospray ionization high-resolution mass spectrometry，LC-ESI-HRMS）分析表明DH1突变株不再产生已知的AZLs，并且相反，重要的新峰被发现（图3c和图S4），尽管只有野生型中AZL水平的0.1%。关于这些新峰的分析，得到了与阿扎霉素F3a，F4a和F5a紧密相关的化合物，除了它们在C-41和C-39有羟基官能团，而不是在C-40和C-41之间的双键（表3c和表S4）。这些化合物被命名为F3arsquo;, F4arsquo;, and F5arsquo;，从大批量发酵中分离出来，并且通过1H NMR and DEPT spectroscopy阐明了他们的结构。质谱数据表明，相比已知的阿扎霉素，在每种情况下失去两个烯烃质子(dH 5.38–5.46, 2H)，并且在dH 3.65 和 dH 4.04处存在另外两个氧键合质子。与这个相同的是，DEPT分析表明在在dC 128.9和dC131.0处缺少两个烯属碳原子（如图S6）。显而易见的是，DH1酶域的失活阻碍了第一轮和第二轮延伸过程中的脱水，因此提供了阿扎霉素聚酮合酶模块1没使用了两次的直接证据。

图3. 基于体内和体外DH1结构域失活的结果，在迭代模块1中ER1结构域可切换的模型。 a）AzlA的域组织。模块1使用两次，并且ER1域的切换状态被编程为在第一轮延伸中处于非活动状态（黑色阴影），但在第二轮延伸中处于活动状态。 b）AzlA（DH1突变体）蛋白的域组织。标记有times;的DH1结构域在211726染色体和AzlA重组多酶中通过位点特异性诱变而失活。 c）LC-ESI-HRMS分析来自野生型211726和DH1突变体的发酵产物。只有AZL的主要产品，F4a及其衍生物F4b出现。 d）LC-ESI-HRMS蛋白质分析，添加了重组的独立ACP1的AzlA和AzlA突变体的体外重建实验。 e）LC-ESI-HRMS分析，除了在分析前将反应混合物进行碱水解外，其他如（d）中的操作。三条迹线以相同的程度呈现。

聚酮合酶AzlA蛋白只有加载模块（LM）和延伸模块1。为了更进一步证明以上的结论，在试管中进行体外分析，拥有跟上述相同的DH1酶域点突变的重组聚酮合酶AzlA蛋白（DH1的突变体），加入翻译后修饰的ACP1酶域后在大肠杆菌BAP1中以液体形式成功表达。在与4-胍基丁酸，纯化的Azl4（连接酶），Azl5（酰基转移酶）和DH1突变的AzlA蛋白的一锅反应中，产生起始单元4-胍基丁酰基-CoA,并被加载到包含DH1突变AzlA蛋白的加载模块的ACPL结构域。为了实现聚酮合酶AzlA蛋白多酶复合物上聚酮合酶的多重翻转，我们的策略是提供额外的ACP1酶域副本。重组的holo-ACP1酶域作为一个单独的蛋白被表达，并从E.coli BAP1中提纯，被加到孵化反应中与模块1中完整的ACP1酶域竞争（图S7）。带有聚酮化合物链的ACP1反应产物由LC-ESI-HRMS监测。在holo-ACP1和丙二酰辅酶A存在下发生以上一锅反应，与两轮延伸的预期产物（8-胍基-3,5- dihydroxyoctanoyl-ACP1）质量数一致的峰被发现（图3d）。与of 6-胍基-3-hydroxyhexanoyl-ACP1质量数相近的一个较远的峰被发现（图3d）。为了证明这些发现，将硫酯结合的产物用氢氧化钾水解，在有和没有holo-ACP1的两种测定中都进行了，并且显示了相同的结果。水解产物的LC-ESI-HRMS分析发现了两个峰，其质量数分别与6-胍基-3羟基己酸和8-胍基-3.5-二羟基辛酸一致，这也与酰基-ACP1物种分析一致（图3e）。总的来看，这些结果确凿地阐明了阿扎霉素聚酮合酶延伸模块1催化两轮连续的链延长循环。在迭代机制中，我们提出完整的阿扎霉素聚酮合酶（图S7），在第一轮延伸之后，ACP1-束缚的聚酮化合物中间体被转移回相对的PKS链上游KS1结构域而不是下游的KS2结构域，可能是因为KS2偏好三酮化合物酰基-ACP作为底物而不是二酮酰基-ACP。值得注意的是，阿扎霉素聚酮合酶开始的两轮延伸循环中，只有一个完整的还原发生。为了研究模块1中ER1酶域的行为，采用跟以上相同的实验方法，其中重组的ACP1被用于与野生型AzlA蛋白（图S7）的一锅反应。因为模块1包含一套完整的还原酶域（脱水酶，烯基还原酶，酮基还原酶），并且将丙二酰基辅酶A作为延伸单元，4-胍基丁酰基起始单元应该延长两个乙酸酯单元，并且两个新形成的beta;-酮基基团应该被完全还原。然而，一锅反应的LC-ESI-HRMS分析表明，产生的酰基-ACP1物质的分子量比两轮完全还原产物的预期低2Da（图3d），因此表明在一个循环中有不完全的还原。为了证明这一点，分析通过碱水解从ACP1上释放的酰基链，表明它是8-胍基四辛-4-烯酸 (图3 e)。因此，AzlA蛋白催化两轮延伸，只在其中一轮烯基还原酶（ER）起作用。在所有天然的阿扎霉素化合物中双键的位置（在C-40和C-41之间）与ER1在第一轮延伸中被失活但是再第二轮延伸中有活性出现的情况完全一致。

这种在阿扎霉素聚酮合酶延伸模块1的程序性迭代，正如先前鉴定的模块程序化迭代的实例，发生在组装线中的某处存在蛋白质-蛋白质界面（此处为AzlA和AzlB之间）。那些先前的例子都涉及在每个链延长迭代循环中相同水平的beta;-酮基的加工。在此，我们提出一个前所未有的例子，其中除了ER每个酶域都在两次连续的延长循环被使用，且ER在第一轮延伸中不起作用（“关”），但是在第二轮延伸加工中起作用（“开”）。然而，模块1的迭代使用和ER1的跳过现象在第一轮延伸中都能归结于动力学控制：ER1酶域的内在选择性，能区别较短的底物，更偏好将酰基链向KS1的反向转移。同样地，对于KS1活性位点被重新利用，通过从相邻的ACPL加载结构域转移4-胍基丁酰基起始单元，反向转移一定会优于KS1的引发。在两轮延伸之后，三酮酰基-ACP中间体的分配更偏好完全还原而不是转移到下一个模块。相邻的聚酮合酶亚基AzlB的下游KS2酶域，能很好的充当“门卫”，偏好于选择性的回收三酮-而不是二酮-酰基链。金链菌素聚酮合酶的研究证据强有力的证明在程序迭代中多种因素的相互作用。

选择性处理在两个连续的聚酮链延伸的迭代过程中，在减少完全迭代的聚酮合酶方面，是一个众所周知的特征。例如，在LovB 聚酮合酶，使用单一聚酮合酶模块合成降胆固醇化合物洛伐他汀的非削弱核心，一个完整的甲基转移酶域选择性甲基化在三轮扩链后形成的beta;-酮硫酯。对LovB的模型底物的体外分析已经证明甲基转移酶对四酮底物具有极好的特异性。并且对于该底物，甲基化有效地优于先前的酮还原。LovB还利用一个外源单体ER蛋白，在八个延伸循环中只特异性地催化三个烯基还原（四肽、五肽和肝细胞中间体）。LovC的详细分析表明，尽管有效底物易于以生产构象来适应，较短的中间体优先在活性位点采用非生产性构象。同时，己烯酮中间体优先经历DA环化。类似的实验将被用来建立在阿扎霉素生物合成过程中将AzlA蛋白ER1结构域从“关”翻转到“开”的显著转换的精确的结构基础。

[*] W. Xu,[ ] G. Zhai,[ ] Dr. Y. Liu, Y. Li, Y. Shi, Prof. K. Hong, Prof. Z. Deng,Prof. Y. Sun

武汉大学药学院组合生物合成与药物发现重点实验室，武汉大学药学院，武汉东湖路185号，武汉430071（中国）

邮箱: yhsun@whu.edu.cn

Dr. H. Hong, Prof. P. F. Leadlay

剑桥大学生物化学系 80网球场路，剑桥CB2 1GA（英国）

[ ] 这些作者同等贡献这项工作。

可以在以下位置找到本文的支持信息：

https://doi.org/10.1002/anie.201701220.

2017 The Authors. Published by Wiley-VCH Verlag GmbH amp; Co.KGaA.

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致谢：

我们感谢上海交通大学的Hongyu Ou教授提供的生物信息学方面的帮助, 以及武汉大学Xudong Qu教授提供的有益的建议。 这项工作得到了国家自然科学基金(资助号： 31270120 to Y.S.)，海外硕士课程(MS2012WHDX042)以及部分英国生物技术与生物学研究委员会(grant BB/I002413/1 to P.F.L.)的资助。

利益相关：

作者表明无任何利益冲突

如何引用: Angew. Chem. Int. Ed.

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