伊朗药用植物内生菌群的抗菌活性研究外文翻译资料

 2022-02-13 20:45:40

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伊朗药用植物内生菌群的抗菌活性研究

Maryam Beiranvand, Mansour Amin, Abdolrazag Hashemi-Shahraki, Bizhan Romani, Sajad Yaghoubi, Parisa Sadeghi

1Health Research Institute, Infectious and Tropical Diseases Research Center, Department of Microbiology, School of Medicine, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran

2Department of Epidemiology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran

3Cellular and Molecular Research Center (CMRC), Faculty of Medicine, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences (AJUMS), Ahvaz, Iran

4Department of Biochemistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta, T6G 2E1, Canada

5Division of Microbiology, Department of Pathobiology, School of Public Health and Institute of Public Health Research, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

6Clinical Biochemistry Research Center, Shahrekord University of Medical Sciences, Shahrekord, Iran

摘要

背景和目标：内生放线菌在植物组织内定植而不会对寄主植物造成损害。 由于这些微生物定居于植物的不同部位并可以阻止植物疾病，因此它们已被用作控制人类疾病的生物制剂。 本研究的目的是分子鉴定和测量从伊朗药用植物中分离的内生放线菌的抗菌活性。

材料与方法：收集23种药用植物样品，灭菌并粉碎。 然后将碎片小块样品直接在三种选择性培养基上培养。 用16S rRNA基因测序方法鉴定生长的菌落。将每个分离物在TSB培养基中培养，然后使用乙酸乙酯提取抗微生物化合物并针对靶细菌进行测试。

结果：23株细菌分离株中有16株（69％）对选定的病原菌，如蜡状芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，肺炎克雷伯氏菌，弗氏柠檬酸杆菌，奇异变形杆菌，福氏志贺氏菌和大肠杆菌显示出抗微生物活性。

结论：我们的研究表明，伊朗药用植物的内生细菌具有较高的系统发育多样性和强效的抗生素活性。

关键词：内生菌，放线菌，药用植物，抗菌剂

介绍

过去几十年来，天然药物来源在医学中发挥了重要作用。 自1981年至2006年以来，近70％的新药和化学制剂具有天然来源（1）。超过22,000种天然产物从微生物中分离出来。 单纯的放线菌生产世界上超过45％的抗生素。 放线菌是革兰氏阳性细菌，在其DNA中具有高鸟嘌呤和胞嘧啶含量。 它们中的一些形成类似于不相关真菌菌丝体的丝状体（2,3）。 放线菌经常在土壤微生物群落中发现并产生包括抗生素（4,5），抗肿瘤化合物（6,7），酶（8）和免疫抑制剂（9）在内的生物活性化合物。 由于细菌耐药性的增加和替代有效的抗微生物药物，重点关注新的抗微生物源是非常重要的。 放线菌生物活性化合物可安全地用于人和兽药产品（3,9）。许多放线菌进入植物内部组织并作为病原菌或内生菌（6）。 居于植物内部组织中的放线菌被称为内生放线菌（10,11）。 它们生活在根，茎，花，果实，种子或植物的许多其他组织中（12），它们可以在不利条件下刺激寄主植物的生长，并且还可以对抗植物疾病（13）。 由这些细菌产生的许多代谢产物具有抗菌活性，例如从Sterptomyces spp中分离出的munumbicin A-D（13-15），celastramycins A-B（16），kakadumycins（17）和二甲基新生霉素（18）。（19）。 本研究的目的是分离和鉴定药用植物内生放线菌的抗菌活性。

材料与方法

样品采集。2013年至2104年期间，从伊朗四个不同省份（胡齐斯坦，德黑兰，Khoramabad和伊拉姆）收集了23个植物样本，包括叶，花和果实。植物由伊朗Chamran大学植物学系确定。 为了细菌分离，将植物的每个部分放入无菌塑料袋中并转移到Ahvaz Jundishapur医学大学的微生物学实验室。

表面灭菌。收集的样品用自来水洗涤，干燥，并通过五步表面灭菌程序处理，包括用5％NaOCl洗涤4-10分钟，用2.5％Na2S2O3洗涤10分钟，用75％乙醇洗涤5分钟，一次用无菌水清洗，最后用10％NaS2O3冲洗10分钟。 所有样品然后在100℃下干燥10分钟（10）。 为了检查灭菌情况，将随机表面灭菌的组织印在血琼脂上（Merck Germany），在28℃下孵育2天，并检查微生物的生长（10,14）。

分离内生菌。将每种植物的三个样品无菌地破碎成小片段并直接放置在国际链霉菌项目2（ISP2）琼脂（HI Media，印度），R3A琼脂（1g酵母提取物，1g蛋白酶 - 蛋白胨，1g酪蛋白氨基酸，1g葡萄糖， 1g淀粉，0.5g丙酮酸钠，0.6g K2HPO4，1g MgSO4·7H2O和18g琼脂在1升蒸馏水中）和血琼脂。 平板在28℃孵育2至4天。 细菌分离株通过它们的形态和它们的集落特征（如大小，形状，颜色和不同温度下的生长速率）来鉴定（图1）。 具有相似形态特征的菌落被归入同一物种（15）。

分子鉴定。使用特定引物对选定的分离物扩增16S rRNA基因。 使用27F（5#39;-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3），1525-R（5#39;AAGGAGGTGWTCCARCC 3#39;）和907-R（5#39;-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3#39;）用ABI 3100遗传分析仪对PCR产物进行测序。 在94℃进行2分钟的初始变性，94℃1分钟，60℃1分钟，72℃3分钟和72℃最终延伸10分钟的30个循环进行PCR 10分钟。 使用染色终止子循环测序Genome LabTM根据制造商的说明（Biometra Co，Ger many）确定PCR产物的序列。

系统发育分析。使用我们的细菌分离株的序列和来自GenBank数据库的菌株和jPhydit程序（16）产生16S rRNA的多重比对。 MEGA版本4（17）被用来构建使用Kimura双参数的邻接系统发育树。 分支和聚类模式的可靠性从1000次自举重复估计。 该树生根于大肠杆菌16S rRNA。

提取抗菌化合物。将分离物在TSB（Tryptic Soy Broth，Merck Germany）中培养并在28℃下温育14至16天，之后我们继续用3种方法提取抗微生物化合物。 在第一种方法中，将一份培养基与一份乙酸乙酯（1:1比例）混合并用磁力搅拌器搅拌6小时。 将有机上清液分离并以5,000rpm离心10分钟。 将乙酸乙酯层转移到干净的烧瓶中，并在50℃下用旋转蒸发器（Heidolph，德国）干燥。 将干燥的提取物溶于2ml乙醇中。 为了测试提取物的抗菌敏感性，将25mu;l乙醇中的每种提取物用于浸泡空白圆片（直径7mm）（18）。在第二种方法中，将另一部分培养基在沸水中孵育5分钟并在冷水中孵育5分钟，然后将一份培养基与一份乙酸乙酯（1：1比例）混合。 如第一种方法所述，然后处理样品。 在第三种方法中，将含有细菌的培养基的最后部分在160W下超声处理3分钟，并如第一种方法所述完成提取方法。 通过对包括金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，弗氏柠檬酸杆菌，弗氏志贺氏菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，蜡状芽孢杆菌和奇异变形杆菌的致病菌的盘扩散测试了使用3种方法获得的细菌分离株。 分别测量每种细菌种类的抑制区域。

结果

抗菌药物敏感性。使用在培养皿中粉碎并培养的植物组织，成功分离出植物相关的细菌（图1）。使用抗生素盘扩散法检查分离的细菌的抗菌活性。 所有分离的细菌都显示出针对所选细菌的抗细菌活性以用于抗生素敏感性。 通过第二种方法（热方法）获得的16株分离物（69.56％）通过产生大的抑制区显示出强的抗病毒活性。 使用第三种方法（超声波方法）获得13种分离物（56.52％），均显示出抗病毒活性。 在第三种方法的分离株中，EB7（从Stachys lavandulifolia的根中分离出来）和EB69（从Physalis alkekengi的根中分离出来）对所有的目标细菌显示出广泛的抗菌活性（表1，图2）。

细菌鉴定。我们对来自23个植物的23个细菌分离株进行了测序并进行了系统发育分析。 16S rRNA的系统发育分析结果（表2和图3）表明，我们的菌株属于不同的细菌种类，包括革兰氏阴性菌（如禾谷镰刀菌）和革兰氏阳性菌（如苏云金芽孢杆菌）。 在我们的菌株中，还有三种菌株无法鉴定。 这些分离株属于鉴定的属，包括分离株EB4（PlanomicrobiumSp），EB11（Bacillussp），EB12（StaphylococcusSp）和EB23（BacillusSp）。 总之，我们的研究结果表明内生细菌具有广泛的多样性。

发现

由于放线菌已应用于生产不同种类的现有药物，最近的研究正在研究新的细菌来源。 这项研究集中在放线菌，特别是放线菌，这是在从选定植物获得的大量分离的细菌中发现的。 我们分离出23株内生细菌分离株，其中19株分离株的菌种经16S rRNA鉴定。 大多数分离株可以考虑用于产生针对目标细菌的抗生素。 23株内生细菌分离株中的两株EB4和EB7显示对蜡状芽孢杆菌的抑制活性。 此外，EB9对金黄色葡萄球菌，弗氏柠檬酸杆菌和弗氏志贺氏菌均有抑制活性。热法获得的16株（69％）对选定的致病生物体显示出强活性，其中两种（EB7和EB69）具有广谱抗菌活性1）。超声波法显示23个分离物中的13个（46％）抑制微生物生长。 研究表明大多数分离的生物体是芽孢杆菌属（25,26）。 与我们的研究类似，Janso等人 报道从热带植物中分离出的123株内生放线菌属中有105株属于17个不同属，还有Sphaerisporangium和Planotetrasporaas属，这些属于以前没有报道过的。 他们有近60％的生物活性（25）。 Strobel等人 分离的链霉菌，Microbispora和Nocardiodesas内生菌，并表明它们的分离菌株产生对革兰氏阳性菌具有抑制作用的抗菌化合物（11）。 另一项研究从26种草药物种中分离出560种内生放线菌。 他们的菌株属于广泛的细菌种类，表现出很强的抗菌特性（27）。

结论

总体而言，研究显示伊朗不同地区分离的内生细菌具有较高的系统发育多样性。 我们的菌株显示出相当的抗菌活性。 这项研究表明，热方法比其他方法分离内生细菌更有效。 内生放线菌可用于生产新的生物活性化合物。 这种化合物可以用于抵抗现有抗生素的致病细菌。

致谢

作者感谢位于伊朗Ahvaz的Jundishapur医学科学大学传染病和热带病研究中心健康研究所的资助（Grant No.91134）。 我们也感谢Abdolreza Namdarian的有益合作。

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