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乳胶涂料的固定酶在快速食品包装中的应用
羧基化苯乙烯-丙烯酸酯胶乳在葡糖氧化酶的催化下的凝固的反应生成物—— GOx可以作为食品包装中的除氧剂。它既在已形成的乳胶膜表面且分散在乳胶颗粒中形成共价固定，或者成为聚合物基质。在后两种情况下，在胶乳分散液中加入酶后，形成聚合物膜。此外，还研究了酶的贮存稳定性和加入粘土的效果。对于给定量的酶，固定在膜表面上的酶显示出比在聚合物基质中存在的酶高约10倍的酶活性，这可能是由于在聚合物基质中存在的扩散限制。然而，存在于聚合物基质内的酶的膜显示出比固定在表面上的酶的膜具有更高的氧去除能力。聚合物基质中的酶之所以显示出比分散体中的酶稍高的活性，是由于固定化过程中使用的活化化学品的负面影响以及共价键合上的构象限制。添加到分散体中的少量粘土降低了酶活性，但随着粘土量的增加，酶活性增加，这可能是因为随着孔隙率的增加，基体渗透率的增加。所有含酶膜的最适储存条件为 8°C，其刚好高于所用聚合物的玻璃化转变温度。
关键词：葡糖氧化酶、固定化、乳胶涂料、活性包装、除氧
引言
食品活性包装是指包装材料通过延长食品保质期或提高包装食品的质量来改变食品包装状态的概念。活性包装应用包括抗微生物添加剂、除臭和湿吸附剂包装，但在食品包装中使用最广泛的技术是除氧。氧气参与食物的变质和腐败反应，其包括了微生物的生长、形状改变、颜色变化和营养损失。因此，为了保持产品质量和延长货架期，必须控制包装中的氧气量。
氧清除剂通常由放置在可渗透袋中的还原铁除去包装内部的氧气。钴盐催化MXD-6尼龙与氧的反应，该反应被商业用作聚酯瓶内的氧清除剂。在包装材料中加入氧清除剂的进一步尝试包括在啤酒瓶中夹在聚酯层之间的铁基氧清除材料和用于莫迪大气包装中的光活化的可氧化多聚物。
一个有趣的替代方案是将酶与包装材料中的除氧功能结合起来。酶是一类特殊的蛋白质，在化学反应中起着催化剂的作用。酶的三维结构对于底物结合是至关重要的，因此它的催化作用也是至关重要的。蛋白质在酸性环境或储存过程中可能发生变性，例如经过热处理，这常常降低酶活性。活性食品包装中最常用的酶是葡萄糖氧化酶（GOX）。该酶催化葡萄糖和氧之间的反应，形成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。通常，这种酶与另一种酶过氧化氢酶一起使用，过氧化氢酶是为了去除过氧化氢。其他基于酶的活性包装包括抗微生物包装中的溶菌酶和柚皮苷酶，它们可以去除柠檬汁中柚皮苷和柠檬苦素的苦味成分。
在基于聚合物的包装材料中使用的酶必须被固定或包封在聚合物基质内，以防止泄漏进入包装食品。固定化也被证明可以提高酶的热稳定性和pH稳定性。固定化GOX的方法包括共价键合、静电相互作用和物理吸附。用作胶乳的阻隔分散涂料（即精细聚合物颗粒的水分散体）具有在纸或纸板等基材上对水、水蒸气、油脂、二氧化碳、氧气、芳香化合物等提供屏障的潜力。目前在屏障应用中使用的胶乳主要是苯乙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丁二烯或乙酸乙烯酯的聚合物或共聚物，即颜料涂料中用作胶乳粘合剂的相同单体。乳胶粒子具有非常大的特殊面积，在干燥过程中，在乳胶膜内形成一个广泛的三维网络。这个网络保留在干膜中。因此，大的表面和大的界面区域可用于通过例如胶乳颗粒表面上的酶等活性化合物的固定来增强功能涂层板产品。
目前，羧基化的苯乙烯-丙烯酸酯胶乳样品已经通过以前用于生物传感器应用和抗微生物包装中的酶固定的技术用GOx固定；研究了酶固定化和包封酶对乳胶膜酶活性的影响；比较了在分散在胶乳颗粒体的酶和已形成乳胶膜表面上固定化酶的活性。此外，还考察了添加矿物剂对酶活性的影响，通过贮存稳定性研究评价了酶在乳胶涂料中的适用性。
实验
材料
羧基化苯乙烯-丙烯酸酯胶乳样品（见表1）由美国费城PA的Rohm和Haas提供。1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）是从美国穆村的Sigma获得。购自Sigma的酶GOX（EC 1.1.3.4，II型，Aspergillus niger，23000单位/g），O-二茴香胺和酶过氧化物酶（EC 1.111.7，IV型，辣根）。从默克（达姆施塔特，德国）获得乙酸钠、乙酸和D-葡萄糖。BioRad染料试剂（目录号500—0 06）是从BioCAD实验室公司（HelCules，CA，美国）获得的。磷酸盐缓冲溶液（PBS）含有8毫克/毫升氯化钠，0.2毫克/毫升氯化钾，1.15毫克/毫升无水磷酸二钠和0.2毫克/毫升无水单磷酸盐，其中都来自默克公司，除了氯化钠来自实验室扫描亚洲有限公司（曼谷，泰国）。高岭土（高岭石，硅酸铝，斯佩儿怀特）由伊姆里斯（英国圣奥斯特）供应。根据生产厂家，80%的粘土颗粒小于2毫米，20%小于0.25毫米，粘土的纵横比为25～30。聚丙烯酸钠分散剂，DISPEX N40，是由CIBA专业化学品（布拉德福德，大不列颠）提供。
表1-本研究中使用的苯乙烯-丙烯酸酯胶乳样品
|
乙烯酸添加量（%） |
干重 |
温度 |
粒径（nm） |
pH |
羧基含量（mmol COOH/g聚合物） |
||
|
胶乳粒子表面 |
乳胶粒子内 |
血清相 |
|||||
|
4 |
49.7 |
3℃ |
159 |
5.7 |
0.18plusmn;0.01 |
0.16plusmn;0.01 |
0.22plusmn;0.01 |
步骤
- 溶液中游离酶
酶溶解在PBS（pH 7.4）中，浓度为4 mg/mL。为了研究连续干燥对酶活性的影响，将酶溶液保持在30℃下24小时，然后在75℃下保持5分钟。将固定化化学品（EDC和NHS）添加到一些酶解液中，以研究它们对酶活性的影响。在所有的实验中，EDC和NHS的量与酶的量的比率是相同的。
- 酶固定化和包封
酶的固定化是用以前的方法进行的。在本研究中，酶被固定在胶乳颗粒表面上的羧基上或胶乳分散体形成的聚合物膜的表面上（见图1）。
对于分散体中的固定化，将乳液分散体用PBS（pH 7.4）稀释至10% W/W。通过添加0.03 M EDC和0.06 M NHS预活化羧基，然后在室温（RT）（～20°C）搅拌1小时（胶乳颗粒表面上的EDC：羧基基团为3∶2）。然后，将GOX加入到浓度为4 mg/mL的分散体中，在RT.搅拌下进行24小时的固定化，再将分散体用于形成乳胶膜，如在成膜段下所描述的。除了用EDS和NHS预活化外，GOX在乳胶膜中的包封与分散体中的固定化方法相同。在酶的活性分析和膜表面上的酶的量的测定之前，不清洗在分散体中固定的酶膜和带截留酶的膜。
为了将酶固定在膜表面上，用PBS（pH 7.4）稀释乳胶分散液，制备乳胶膜，如在成膜段所述。在含有0.03 M EDC和0.06 M NHS的PBS中，膜预活化1小时。然后将膜浸入含有4毫克/毫升GOX的PBS中，并在RT.搅拌下进行24小时的固定化，用PBS清洗膜除去非结合的酶和活化的化学品。
图1-酶固定化过程示意图
- 在分散相中固定化；（b）固定在由胶乳分散体形成的聚合物膜的表面上
- 粘土添加
为了研究矿物添加对酶活性的影响，在一些胶乳分散体中加入高岭土。使用的粘土首先分散在水中，使用聚丙烯酸钠分散剂，DISCEX N40（0.2克分散剂/克粘土），和超声波均质机（振克公司，VCX130PB-1，声能和材料公司，Newtown，CT，美国）。然后将粘土分散体与乳胶分散体和PBS以不同的比例混合，以获得在随后的膜中胶乳、粘土和酶之间的最终比例，如表2所示。根据先前描述的方法，酶在这些乳胶/粘土分散体中被固定和包封，除了粘土最多（粘土III）的情况下，由于存在乳胶颗粒含量低，在分散体中没有固定化。所有膜中含有相同量的酶，但乳胶和粘土的量不同。第一种含粘土的乳胶膜，称为粘土I，含有与未加粘土的样品相同的胶乳颗粒，在酶固定化和包封段下描述。
表2-胶乳、粘土和酶的量
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无粘土(g/cm3) |
粘土I (g/cm3) |
粘土II (g/cm3) |
粘土III (g/cm3) |
|
|
胶乳 |
1.1 |
1.1 |
0.5 |
0.1 |
|
粘土 |
- |
0.3 |
0.7 |
1.5 |
|
酶 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
- 成膜
将分散体涂布在直径为8厘米的聚苯乙烯盘上的琼脂平板（高凝胶强度琼脂），在30℃下干燥24小时，然后在去离子水中浸泡后从琼脂平板上除去乳胶膜。
- 酶活性
用O-二苯胺法测定过氧化氢的含量，测定酶活性。在由GOx催化的葡萄糖氧化过程中，形成葡萄糖酸和过氧化氢。O-二苯胺染料是无色的，但在过氧化氢和酶过氧化物酶的存在下，它被氧化成具有红色的化合物。测定混合物含有0.1毫升过氧化物酶溶液（60单位/毫升），2.4毫升染料缓冲液（0.21毫米邻二苯胺在0.05 M乙酸缓冲液pH 7.4）和0.5毫升D-葡萄糖（10%重量）。对游离酶在溶液中的活性、固定化酶和包埋酶的活性进行了评测。通过添加100毫升游离酶溶液或一种含酶乳胶（LM）（2times;4 cm）进行反应。在RT.培养5分钟后，用分光光度计UV-3101PC（岛津，京都，日本）测定525 nm处的吸光度。所有样品均一式三份进行检验。在黑暗条件下，在零下20°C、8°C和20°C下，将含酶膜和游离酶保存在14天后，测定酶活性。
- 酶量
用BiOrad蛋白染料试剂固定在乳胶膜表面上的酶的量。用MQ水稀释BIORAD原色染料溶液五次。每个乳胶膜浸渍在5毫升染料溶液中。反应3小时后，用紫外分光光度计（UV-3101PC）（岛津）测定465mu;m染料溶液的吸光度。对每个样品的三个重复进行了测试。为了校准，将已知浓度的GOx溶液（100毫升）添加到5毫升染料溶液中。标准品在室温下保持3小时，在465 nm处测量吸光度。
实验还测定了在分散过程中固定化后共价键与非共价键结合酶的比率。固定化后，部分分散体用0.2 mm尼龙滤料（TITAN 2 HPLC过滤紫，17 mm，0.2 mm，尼龙膜，罗氏00056435，TITAN，Rockwood，TN，美国），在滤液中收集非共价结合的酶。然后，用去离子水洗涤几次，以相同的方式收集添加有非共价键的酶的分散体的血清相。通过添加100毫升的LT溶液对Bier-RAD法测定样品中的酶的量，并按前面所述的方法对样品进行评测。
- 薄膜表征
用场发射扫描电子显微镜（FESEM）（JSM-6900LV，JEOL，东京，日本）对乳胶膜的结构进行了研究。膜的横截面是通过在浸渍在液氮中后的膜来得到的。在SEM表征之前，每个样品都涂有Pt。用菜籽油在23°C和50% RH的吸油试验测定了乳胶膜的孔隙率，在23°C和50% RH预处理1个月，并重复分析。
- 力学性能
采用配备静态加载单元（plusmn;2 kN，编号UK81-ISTRON）的ISTRON 5544（英斯特朗，Canton，MA，美国），以10毫米/分钟的速度拉伸试验研究了不同乳胶膜的机械性能。对每个样品的六个重复进行了分析。薄膜尺寸为17times;5times;0.20 mm。
- 统计
采用双尾学生t检验评价不同样品酶活性差异的统计学意义，P值低于0.05。
结果与讨论
溶液中游离酶的活性如图2所示。根据生产商，Gox的理论活性在pH 5.1和35°C下为23000个单位，相当于消耗4.14毫克葡萄糖/Mg酶每分钟。溶液中游离GOX的最佳条件是在35°C时pH为5.1。在时间t＝0（图2中表示为“直接”）的当前活性（在pH 7.4和RT下测量）为0.46毫克消耗葡萄糖/Mg酶每分钟。这一结果与用类似方法测定酶活性和相同批次GOX所获得的先前结果一致。
图2-游离酶在溶液中的活性
酶活性-溶液中的自由GOx
在不同温度下储存14天（图2中第二至第四条）的溶液后，无论储存温度如何，活性降低约30%。
我们研究了75℃左右的温度对造纸胶乳涂料干燥温度的影响。如图2（第五和第六条）所示，在30°C处理时，游离酶的活性明显降低，但在75℃的短时间处理后没有明显的下降。在 30°C处理24 h后，有85%的酶活性保留，在 30°C处理24 h，75℃处理5分钟后酶仍保留83%的活性。图2
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