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LEAFPROCESSOR：一种使用轮廓弯曲能和形状聚类分析的新叶表型工具
摘要
在控制叶片形状的遗传因素鉴定方面取得了显著的进展，然而，没有量化的综合解决方案对叶片形态进行分类。特别是，对边际增长的局部变化的定义了许多不同的形状的分析，仍然存在问题。
前言
叶片是大多数植物光合作用光截获的主要场所。尽管有这个共同点，叶子的存在还是有许多不同的形式，来反映各种进化策略以应对不同的环境。几乎可以确定的是，当考虑叶片形状时，叶片边缘是非常重要的。实际上，叶片形态的经典植物学描述很大程度上取决于叶片边缘形状的全局和局部变化。例如，虽然有些叶子具有平滑的边界，但许多叶片以具有不平滑的区域为特征。根据这一区域不光滑的程度和频率，叶子边界可以被描述为像浅裂的或锯齿状的(或者事实上是两者的结合)。最近的研究已经确定了转录因子模块和支持叶片发育这一关键方面的模式化过程。在生理学方面，有人认为，边缘形状的差异会影响叶片承受环境压力的能力，事实上，叶子边缘形状已经被用作古植物学的温度估计的代表。叶片边缘形态的评价在植物科学的许多领域具有重要的意义。
传统上，基于视觉检查的植物术语已经被用于描述叶形。然而，这种方法涉及到使用一系列特定的术语，在其应用中往往是主观的，因为这些术语不是基于精确的量化。为了解决这一问题，提出了许多单指标形状参数来量化叶片边缘的复杂性。其中包括周长、面积比，形状因子(4pi*面积/周长2)，基于角度的边缘粗糙度和分形维数。这些参数有效地量化了叶子边缘在全叶层的复杂性，但还没有提供关于叶片边缘复杂性的局部分布的信息。此外，虽然单指标参数是统计比较的有力工具，但它的局限性在于，它们通常不是特定的叶型。因此，考虑到有效的形状描述需要结合几个参数。
比较复杂的叶子形状的另一个选择是基于地标的方法。为了从不同的叶型中提取出主要的差异，我们可以手工标记出齿状和鼻窦的尖端，并进行统计分析，就像在Young et al.(1995)和McLellan amp; Endler(1998)中。这些方法允许对叶片形状的差异进行分类，尽管对产生的生物事件的形状差异负责的主要因素的特征是有问题的。此外，这些方法通常也包含了主观性元素，因为用于测量的标志是手动选择的。并且，主成分识别出的变异数依赖于可用叶样本的统计分布。综上所述，虽然对叶型的分析已经发展了许多方法，但每种方法都有其优点和缺点，没有一种方法适用于所有情况或实验方法。
我们之前的工作使我们把焦点集中在叶子的关键区域，大量的证据表明，与模式、信号和形态发生有关的重要事件都发生在叶子的边缘。为了更深入地分析叶片边缘，我们着手开发一种方法，可以更好地定量地比较叶片边缘所定义的形状。由于在许多叶片上有明显的不均匀分布，我们实现了一种解决方案，允许对叶周长的局部区域进行分析，并对全局范围进行分析。这一解决方案涉及到一种称为弯曲能的尺度无关的度量，这是本文所描述的。此外，由于(如前所述)在所有情况下，对于叶形的描述和比较，没有一个参数是最优的。在比较所有情况下，我们将这个新解决方案合并到一个软件包(leafprocessor)中，它允许对许多其他标准参数进行分析。该程序提供了10种类型的单指标形状参数，以及一个使用k-means聚类来识别群体内的形状群的标量独立的PCA。因此，该程序允许对叶子形状进行综合分析和比较，同时使用单指标参数(用于对叶形的预定义特征进行直接统计分析)和PCA(用于检测非预定义特征)。leafprocessor以半自动的方式执行所有的处理(从叶子的轮廓提取到参数的测量以及统计分析)。此外，该分析还以自由标记的方式进行，因此，理想的分析方法是用一种相对可变的锯齿状叶，如拟南芥的成年叶片。
为了演示leafprocessor的包，我们实施了九种显示各种叶形式的拟南芥基因型的分析。 负责这些形状变化的突变先前已被分析并且鉴定了相关的基因产物（Kim等，1998; Prigge＆amp; Wagner，2001; Ullah等，2001; Ohno等，2004; Nelissen等， ，2005）。 这表明，改变高度不同组基因产物的表达可导致明显相似的表型结果。 我们推论，对形状变化的更精确的定量分析可能揭示更微妙的表型，这可能为未来的研究提供信息，旨在揭示这种多种遗传途径如何影响形态发生的谜题。 这里报告的分析提供了对这些叶形突变体基础变化性质的更深入的了解。
材料和方法
植物材料
除了Col-0和Ws-2，拟南芥还有以下突变体(见表1):an (Kim et al.， 2002)， elo1-1 (Nelissen et al.， 2005)， gpa1-1和gpa1-2 (Ullah et al.， 2001)， jag1 (Ohno et al.， 2004)， rot-3 (Kim et al.， 1998)和se (Prigge amp; Wagner, 2001)。gpa1-1、gpa1-2、rot3-1和se的种子从NASC (NASC, Nottingham, UK)购买。种子使用20% (v: v)水漂白剂溶液和0.1% (v: v) Tween 20 (Sigma)进行表面灭菌，用灭菌水冲洗三次，在播种前将其置于黑暗中4摄氏度。每个培养皿中有3颗种子(直径5厘米，深度2厘米)，其中含有半强度的Murashige和Skoog盐混合物，有0.8% (w: v)琼脂的1% (w: v)蔗糖固化，生长条件为100 mu;molm-2s-1光，使用16:8h光周期和22℃: 18 ℃ (light: dark)的温度体系。
表1 本研究中使用的拟南芥的野生型和突变体系
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突变体 |
蛋白质（推定的功能） |
文本描述 |
定量测量 |
参考 |
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an |
羧基末端结合蛋白（囊泡运输/微管/动力学） |
拉长叶形，减小宽度 L:W比值更高 |
是 |
Tsuge et al. (1996) |
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elo1-1 |
组蛋白乙酰转移酶复合物（RNA聚合酶募集） |
减少宽度,长度增加 |
否 |
Nelissen et al. (2005) |
|
gpa1-1and gpa1-2 |
GTP结合蛋白（讯息传递） |
面积增加，腐状 |
是 |
Ullah et al. (2001) |
|
jag1 |
锌指蛋白（转录） |
像切碎的锯齿状叶 锯齿状的锯齿状的叶片尖窄，叶子细长 |
否 |
Ohno et al. (2004) |
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rot3-1 |
细胞色素P450（油菜素内酯的合成） |
圆叶，长度减少，宽度不变，L:W比值更小 |
是 |
Tsuge et al. (1996) |
|
se |
锌指蛋白（转录） |
锯齿状叶 |
否 |
Prigge amp; Wagner (2001) |
L:W,长:宽
图像数据采集
每株生长14至24片叶片（每株植物一片，播种后28天叶片数目6）固定在乙醇和乙酸（7:1，v:v）的混合物中。 将固定的叶片转移到50％（v:v）乙醇水溶液中，小心压平，然后使用安装在立体显微镜上的电荷耦合装置照相机（Diagnostic Instruments Inc.，MI，USA，Sterling Heights，MI，USA） （MZFLIII; Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）以13919DPI作为8位灰度值tiff文件。
表2 由LEAFPROCESSOR提供的单一度量参数
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参数 |
说明 |
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面积 |
叶片面积 |
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长度 |
叶片最大长度 |
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宽度 |
叶片最大宽度 |
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周长 |
沿着叶片的周长 |
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P:A |
周长:面积 |
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L:W |
长:宽 |
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紧密度 |
周长2:面积 |
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偏心率 |
共享重心的椭圆的L：W比，惯性主轴和中心矩与叶片形状的比率 |
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全叶弯曲能 |
沿着周边的轮廓曲率的平方与周长的积分 |
|
扇形弯曲能 |
沿着扇形边界的轮廓曲率的平方与扇形周长的积分 |
LEAFPROCESSOR的实现
我们实现了一个软件系统（LEAFPROCESSOR器），该系统除了具有k均值聚类和区分指数的PCA之外还提供各种单度量叶形参数（表2）。 图1显示了LEAFPROCESSOR软件中形状处理和分析的工作流程。 该LEAFPROCESSOR系统是在Linux Ubuntu下使用C /C 和Matlab R2007a（Mathworks，Natik，MA，USA）实现的。LEAFPROCESSOR将在2010年作为独立程序提供。 Matlab代码和LEAFPROCESSOR轮廓数字化程序可在线获取（http://gips.group.shef.ac.uk/resources.html）。
图一LEAFPROCESSOR从叶轮数字化到统计分析的工作流程。从灰度值图像(a)中通过阈值(b)获得二值图像; 边缘检测创建边界迹线（c）; 用10个点手动初始化轮廓得到（d）。在边界(e)上自动添加50-60个点，通过插值和采样（弧长参数化）（f）将500个点均匀分布在叶轮廓上。 随后，获得单度量形状参数和主成分分析（PCA）。
图像处理和叶片轮廓数字化
LEAFPROCESSOR检测叶轮廓并以无地标的方式均匀分配轮廓上的500个点。首先，如Weight（2008）和Bylesjo（2008）等人所实施的那样。对图像的灰度值应用阈值以获得二值图像（图1a，b）。然而，简单的阈值技术经常检测到由于幼叶边缘的毛状体，不均匀的照明或叶面阴影而造成的叶子假轮廓。因此，第二阶段应用三种技术来获得精细的叶子轮廓（图1c e）。使用Canny边缘检测器（Canny，1986）沿着形状轮廓（图1c）创建激活轨迹，并且称为Snakes或Active Contours的机制（Kass等，1987; Blake＆amp; Isard，1998）为用于在初始叶形表示周围拟合一系列50个60个轮廓点。这些算法取自英特尔OpenCV图像处理库（http：// sourceforge.net/projects/opencvlibrary/）。图1（d，e）显示了初始化和拟合轮廓。应该注意的是，初始点可以自由分配，并且不需要手动设置特定的地标（轮廓的起点和终点除外）。这与以前发表的一些叶形分析方法（Langlade et al。，2005）形成鲜明对比，并建立在以前的形态分析基础上（参见Slice，2007）。另外，在自动轮廓检测明显不正确的情况下，用户可以对点分布进行小的校正。
在最后阶段，通过样条插值创建平面曲线。使用Matlab Spline工具箱进行用于获取形状轮廓的平面曲线的样条拟合。从该曲线表示中，在每个叶轮廓的每个点（弧长参数化）之间以相等的曲线长度对500个点进行采样。然后形状自动旋转，使得最长叶片延伸的轴线与y轴对齐。用户可以定义叶基。然而，我们还通过将叶片基部定义为叶柄与平均宽度相比增加了40％的点来实施本研究中叶片和叶柄连接处的数学描述。这个值可以被用户改变。然后将形状基部的中间转换为坐标原点。图2显示了本研究中分析的每株植物品系的两个实例获得的形状。为了便于进一步分析叶子形状的潜在差异，最终形状被进一步分成四个部分。Y轴形成垂直分割，水平分割在叶长的50％处进行（图1f）。这些部门被标记为：PL，左近; P
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