对于通过复合底物诱导的青蒿草GZ-2生产高效木质素分解酶的见解外文翻译资料

 2022-03-22 21:20:00

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对于通过复合底物诱导的青蒿草GZ-2生产高效木质素分解酶的见解

摘要：

背景：在草酸青霉菌GZ-2诱导木质纤维素分解酶的生产中，农业残留物的分解比纯化纤维素更有效，但在木霉木霉RUT-C30中，纯化纤维素诱导更有效的应答。为了了解原因，我们设计了人工模拟植物生物量（纤维素加木聚糖），研究了各组分在草酸青霉菌GZ-2生产的木糖醇分解酶生产中的作用和关系。

结果：研究了木质纤维素分解酶活性的变化，涉及（半）纤维素分解酶的基因表达和生长在微晶粉末纤维素（A），木聚糖（X）或两者（AX）的混合物上的培养物的分泌物）。木聚糖添加到纤维素培养物中不影响真菌生长，但显着提高了纤维素酶和半纤维素酶的活性。在AX处理中，纤维素酶基因（egl1，egl2，egl3，sow和cbh2）和半纤维素酶基因（xyl3和xyl4）的转录物显着上调（p lt;0.05）。生物质降解质子在分泌物中的比例发生改变，特别是增加了纤维素酶和半纤维素酶的百分比。与微晶粉末纤维素处理的分泌物相比，AX分泌物中纤维素酶和半纤维素的百分比分别从4.5％和7.6％提高到10.3％和21.8％。纤维二糖水解酶（由cbh2和xyl2编码）在纤维素分解和木糖分解基因中以最高水平转录。只有几种重要的蛋白质，如膨胀素，纤维二糖水解酶和内切-beta;-1,4-木聚糖酶才被AX诱导。Bray-Curtis相似性指数，树状图分析和多样性指数均表明由草酸青霉菌GZ-2产生的分泌物其分泌物优选降解复合物底物。

结论：将木聚糖添加到纤维素酶介质中不仅诱导更多的半纤维素酶，而且还强烈地激活纤维素酶的产生。生物降解蛋白在分泌物中的比例显着改变，纤维素酶和半细胞的比例增加的尤为明显。

关键词：Secretome，草酸青霉菌，纤维素和木聚糖，木质纤维素分解酶，基因表达

背景

随着化石燃料的枯竭和全球日益增长以及对燃料的需求，木质纤维素酶的转化已经使原料成为可发酵糖成为清洁和可持续燃料生产的有吸引力的替代品。真菌是木质纤维素分解酶[1]的主要来源, 用于酶促的木质纤维素分解酶的转化主要包括纤维素酶和半纤维素酶，

将木质纤维素分解生物质转化为可发酵糖。虽然在酶生产和木质纤维素原料的酶糖化方面取得了一些进展，但高成本仍然是阻碍行业发展的瓶颈[2]。

在过去几十年中，许多高产的纤维素分解菌已被分离出来，并被报道[3,4]。然而，关于木质纤维素分解酶在复合基质上的诱导和抑制机制的报道相对较少。高产木质纤维素分解酶生产需要相应的物质作为真菌的诱导剂。通常，纤维素是许多丝状真菌，如木霉属（Stricgillus spp。），曲霉属（Aspergillus spp。）和青霉属（Penicillium spp。），生产纤维素酶的有效诱导底物。纤维素本身不能直接触发木质纤维素分解酶的诱导，因为它是不溶的[5]。可溶性糖类中，已经证明纤维二糖，槐糖，乳糖，山梨糖和半乳糖在里氏木霉中可以诱导纤维素酶合成[6-9]。半纤维素酶通常由半纤维素分解聚合物诱导合成，木聚糖是木聚糖酶生产中最有效的诱导剂。但是，当使用复合底物作为诱导剂时，纤维素酶和半纤维素酶的诱导的具体情况未被很好地表征。虽然纤维素是诱导纤维素酶的良好底物，但也会产生其他酶如木聚糖酶[10]。在乳糖（0.8％）和木聚糖（0.2％）的混合物上培养的木霉木质纤维素酶和纤维素酶的含量显着高于单独的任一种基质上的培养物[11]。这些报告表明，在这些酶的诱导中存在复杂的相互作用。

在世界范围内，农业废物是可再生且丰富的，它们可以作为廉价原料用于生产生物质降解酶。在其他地方已经报道了这些应用，这些酶将植物生物质糖化用于生产生物乙醇[12-14]。许多报道发现，许多真菌中的酶[15,16]，在诱导生物量降解时，农业废物优于纯纤维素。然而，对为什么复合底物可以诱导更多的生物质降解酶，以及真菌如何在酶生产过程中与复杂木质纤维素反应的全面了解仍然缺乏。木霉属和曲霉菌的调节和分泌特征已被很好地研究和表征[17-19]。最近研究人员已经研究了真菌对植物生物量的响应，以及使用模型菌株黑曲霉的反应机制[20-22]。许多研究人员曾经调查了木霉属的分泌物和转录组。曲霉属（Aspergillus spp。）可由不同类型的植物生物诱导[10,23-26]。然而，不同真菌中酶诱导的机制显示出明显的相似性，但也表现出纤维素酶和半纤维素酶编码基因表达调节的差异[27]。在以前的研究中，农业废弃物诱导的木质纤维素分解酶活性显着高于草酸青霉菌GZ-2纯化纤维素诱导的酶活性。然而，这个特征在里氏木霉RUT-C30菌株中不存在（数据未发表在我们的实验室中），表明草酸青霉素GZ-2可能具有不同的调节机制和产生木素分解酶的诱导机制。

了解丝状真菌草酸青霉菌GZ-2如何响应植物生物量并诱导酶混合物降解植物聚合物，可以研发新策略来改善第二代生物燃料的生产。 每个复合植物生物量成分（如纤维素和木聚糖）在诱导和调控木质纤维素分解酶基因表达和蛋白质谱中的关系和作用仍然不甚了解。 因此，为了模拟植物生物量，本研究设计了含有微晶粉末纤维素和木聚糖混合物的人工混合基质。 这项研究的目的是为了调查诱导型水解酶如何响应纤维素和木聚糖，及其与蛋白质表达的关系和作用，木质纤维素分解酶的活性。

结果:

不同底物诱导的酶活性: 当葡萄糖（G）,微晶纤维素（A），木聚糖（X）和微晶纤维素和木聚糖的混合物（AX）被用作唯一碳源时，在过程中测定评估了草甘膦GZ-2的各种酶的生产，结果如图1所示。在微晶纤维素和木聚糖的混合物处理中获得了FPase，CMCase和木聚糖酶的最高的酶活性。由AXwere诱导的beta;-葡萄糖苷酶，beta;-木糖苷酶和纤维二糖水解酶的酶活性处于中间水平，这些酶活性是葡萄糖处理中最低的。在第7天的测定结果中，AX处理中的木聚糖酶活性分别比X和A处理高3.5和6.5倍。里氏木霉RUT-C30的FPase，CMCase和木聚糖酶活性显示在附加文件1：图S1中。如预期，A和X分别是纤维素酶和木聚糖酶生产的最佳底物。将木聚糖添加到纤维素介质中显着降低了FPase活性，但对木聚糖酶活性几乎没有影响（附加文件1：图S1A）。

为了确定AX为底物菌所产酶的酶活性的增加是否是由于草酸青霉菌GZ-2的真菌生物量的增加，我们检查了草酸青霉菌GZ-2在各种底物上的生长行为。 如附录2所示：图S2A中，草酸青霉菌GZ-2在AX上的生长速度略快，但在第三天之前没有显着性差异。 A上的真菌细胞随着时间的增加而增加，并在发酵结束时达到峰值。 确定四种底物中的蛋白质浓度，并显示于其中。附加文件2：图S2B。 在发酵后期的AX处理中发现最大蛋白质含量的值（2.2mg / mL）。

培养上清液中的蛋白质谱：SDS-PAGE的蛋白质谱图如图2A1所示。使用Quantity One（Bio-Rad，USA）自动检测条带，如图2A2所示。相较在A，X和AX泳道中检测到更多的蛋白条带。酶谱分析表明，在A，X和AX通道中分别观察到具有纤维素酶活性的8个，5个和9个蛋白质条带（图3A1）。在G泳道，只有三条较弱的条带。如图3A1所示，AX和A泳带。具有相同数量的CMCase活性条带，但是泳道AX的淡红色水解区明显大于A泳道。与泳道X相比，AX泳道不仅显示更多的蛋白条带，而且蛋白质条带更明显。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS / MS）。表1中的结果表明，大多数鉴定的蛋白质是纤维素酶，也具有其它糖苷水解酶。通过酶谱分析，具有木聚糖酶活性的酶的半纤维素分布图如图3A2所示。类似于纤维素酶酶谱，在AX泳道中观察到最多数量的是木聚糖酶活性带（十个条带），而在G泳道中没有发现条带。 MALDI-TOF-MS / MS鉴定结果表明，发现了大量的半纤维素酶，如推测的内切-beta;-1,4-木聚糖酶，beta;-1,4-甘露聚糖酶和alpha;-L阿拉伯呋喃糖苷酶。我们使用凝胶内活性测定来检测beta;-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶活性，结果显示在图3A3，A4中。在四条泳道中，一个条带在每条泳道中显示出beta;-葡糖苷酶活性，但AX泳道的水解区域最亮。对于纤维二糖水解酶，除了泳道G，在每个泳道中都能检测到一个条带。

不同底物中木质纤维素降解基因的转录水平：

在不同底物处理下，草酸青霉素GZ-2中木质纤维素降解基因的转录水平如图4所示。第二天测定转录物谱，因为真菌GZ-2的生长在第3天后几乎停止，所以处理在四个底物时，研究的编码纤维素分解酶的基因在各个水平上转录如图4A。在A，X和AX处理下，基因转录显著高于G处理水平。在所有处理条件中，cbh2转录物的水平明显高于其他酶编码基因的水平。类似地，AX治疗中检测到egl1，egl2，egl3，sow和cbh2的转录水平明显高于A或X处理的转录水平（P lt;0.01）。意外的是，在X治疗中观察到bgl转录物的转录水平最高。在所有处理中，cbh1的表达水平维持在较低的水平。当以G作底物时，观察到所有基因以非常低水平的组成型进行表达。

半纤维素分解基因（xyl1，xyl2，xyl3，xyl4，arf，b-x和ma）在各种底物（G，A，X和AX）的诱导下的表达水平各有不同（图4B）。 所有半纤维素分解基因中，表达效率最高的的基因是xyl2。 预期所有半纤维素分解基因的表达明显的高于聚合物底物，而不是葡萄糖（至少P lt;0.05）。有趣的是，以AX为底物的基因xyl3和xyl4的转录水平比其他底物的转录水平高得多（在 最小P lt;0.05）。 X和AX处理之间没有xyl1的转录水平差异，但明显高于A为底物的转录水平（P lt;0.01）。 与其他底物地诱导相比，X为底物诱导的arf和b-x的表达水平显著提高。 然而，值得注意的是，A是诱导ma表达的底物得表达水平最高的。

不同底物诱导的草酸青霉素GZ-2的分泌物

由不同底物诱导的草酸青霉素GZ-2的分泌物由于酶谱不能准确显示单个蛋白质的变化，所以用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS）分析和鉴定不同基因诱导的分泌物底物。在维恩图（图5）中，108种需要鉴定的蛋白质（42.5％）仅在一个条件下存在。四种分泌物的比较说明了131种需要鉴定的蛋白质（51.6％）由两种或三种培养物共同产生。然而，在所有四种分泌物中仅存在34种蛋白质，相当于所有蛋白质的13.4％（附加文件3：表S1）。在不同底物（G，A，X和AX）上生长的草酸青霉素GZ-2的分泌物中鉴定的蛋白质列于附加文件4：表S2中。如图6所示，在分泌物中鉴定的蛋白质以功能分类可分为纤维素酶，半纤维素酶，其他糖苷水解酶，果胶酶和几丁质酶，细胞壁合成代谢蛋白。在G，A，X和AX为底物的分泌物中的纤维素酶的百分比分别为1.0％，4.5％，5.0％和10.3％。以G，A，X和AX为底物的分泌物中的半纤维素酶分别为5.9％，7.6％，12.1％和21.8％。鉴定的蛋白质的分子量和等电点的分布示于附加文件5：图S3中。大多数鉴定的蛋白质的分子量范围为15至150kDa，其等电点范围为4.0至11.5。通过Bray-Curtis算法，相似度值分布在A，X和AX底物上的木素纤维素降解蛋白（纤维素酶和半纤维素酶）gt; 70％（表2）。然而，。由G和其他底物诱导的木质纤维素降解蛋白（纤维素酶和半纤维素酶），相似性值在lt;50％之间。纤维素酶，半纤维素酶和其他蛋白质的聚类模式如图7所示。由AX诱导的纤维素酶和半纤维素酶的表达模式与A和X聚集，而G形成另一个单独的簇（图7A）。然而，A和X的其他糖苷水解酶，细胞壁生物合成代谢蛋白和由G诱导的蛋白质的表达模式聚集，由AX为底物的另外形成另一个单独的簇。使用香农维纳指数（H）和辛普森多样性指数（D）（附加文件6：表S3）进一步评估各种底物对草酸青霉素GZ-2表达的功能蛋白多样性的影响。由G，A，X和AX诱导的鉴定蛋白的H指数分别为0.64,0.63,0.60和0.76。由G，A，X和AX诱导的鉴定蛋白的D指数分别为1.96,1.98,1.93和2.27。当GZ-2在含有1％（w / v）G的培养基中生长时，总共鉴定出101种蛋白质，并且仅由G诱导26种蛋白质。在G培养中仅鉴定出一种纤维素酶（beta;葡萄糖苷酶BGL1,525581542）。 在从A培养物获得的分泌物中，鉴定了157种蛋白质，由A诱导了43种蛋白质。在该分泌物中存在三种主要类型的纤维素酶（内切葡聚糖酶，beta;-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶）和许多半纤维素酶，共鉴定了141种蛋白质，24种蛋白质仅存在于X分泌物中。 在AX的分泌物中，鉴定了86种蛋白质，其中仅15种由AX诱导出。 AX能特异性诱导两种纤维素酶（膨胀素和纤维二糖水解酶）和四种半纤维素酶。

纤维素分解蛋白的表达和鉴定

纤维素的完全降解需要三种主要的纤维素酶：内切-1,4-beta;-葡聚糖酶，外-1,4-beta;-葡聚糖酶和beta;-葡糖苷酶。 在AX分泌物中鉴定出的纤维素分解酶的种类数量最多（9个纤维素酶），主要包括三种的纤维素酶，溶胀素和纤维素单加氧酶（Cel61A）。 纤维素酶在AX分泌物（10.3％）中的比例比A（4.5％）或X（5.0％）分泌物的高出两倍以上。 在A和X分泌物中鉴定出相同种类数的纤维素酶（7）。 当草酸青霉素GZ-2在G上生长时，仅检测到一种纤维素酶。不同底物上纤维素分解蛋白质的比较的定量表达丰度示于表3中。推测的beta;-1,3- 1,4-葡聚糖酶，纤维素单加氧酶Cel61A和纤维二糖水解酶Cel6A分别为4.46，2.12和7.15。 与X处理相比，AX处理中大多数纤维素酶的表达明显上升。在AX处理中的大多数纤维素酶的丰度比在X处理中高出100倍以上。

半纤维素酶和糖苷水解酶的表达和鉴定

复合半纤维素的降解需要不同的酶的协同作用，有半纤维素酶，包括

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