预发酵过程提高银杏叶中黄酮类化合物的提取量外文翻译资料

 2022-03-24 22:36:32

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预发酵过程提高银杏叶中黄酮类化合物的提取量

Jiahong Wang,dagger; Fuliang Cao,*,dagger; Erzheng Su,Dagger; Caie Wu,dagger; Linguo Zhao,# and Ruifeng Yingdagger;

dagger;College of Forest Resources and Environment, Dagger;College of Light Industry Science and Engineering, and #College of Chemical
Engineering, Nanjing Forest University, Nanjing 210037, Peoplersquo;s Republic of China

【摘要】本文介绍了一种真菌预发酵的处理方法，以提高银杏叶中黄酮类化合物的提取效率。此方法的真菌是从树龄大的银杏树下的土壤中筛选出来。用一种涉及18S rDNA序列的分子鉴定方法分离并鉴定了23类共76种菌株。其中使用银杏叶作为生长培养基的三十三种菌株生长良好。并且一个名为Gyx086的菌株具有更高的黄酮类化合物提取产量，且与对照组更类似，因此最终被选择作为预发酵处理的菌种。专业通过响应面法优化主要的发酵因素。总黄酮提取的最佳条件温度为27.8℃，水分含量为64.2％，发酵时间为61小时。在最佳条件下，实际总黄酮产量为27.59plusmn;0.52mg / g干重培养样品，这比未发酵的银杏叶样品高出约70％。

【关键词】真菌 银杏叶 固态发酵 黄酮 响应面优化法

前言

银杏是最受欢迎的植物之一，含有一些活性成分，如黄酮和花青素; 因此，在中国古代它被用于疾病的治疗。 第一次提到把银杏叶用于医学目的可以追溯到1505年刘文泰的 “本草品汇精要”一书。 把银杏叶用于改善全身的血液循环起始于20世纪60年代的德国。银杏叶提取物有两种类型，即全提取物和标准化提取物。 前者通常用酒精提取制备，并含有可溶于其中的所有组分。 后者是最常见的一种，它含有6％的萜烯三内酯（TTLs），24％的黄酮醇糖苷和lt;5ppm的银杏酸。

银杏叶中的黄酮类化合物是最受欢迎的草药补充剂之一。 叶子富含各种类黄酮，包括黄酮醇苷，双黄酮，原花青素和它们的异黄酮; 黄酮醇糖苷在银杏叶和提取物中最为丰富。黄酮醇苷的水解产物含有三种主要的黄酮醇苷元，即槲皮素，山奈酚和异鼠李素，它们在叶中只有少量存在。黄酮类成分是被认为是防止毛细血管脆性的保护剂、抗氧化剂和抗炎剂，可减轻组织损伤引起的水肿，以及作为自由基清除剂。因此，银杏提取物物（EGB）。被广泛用于药物、食品和化妆品中。

不同比例的乙醇/水和丙酮/水和纯甲醇是黄酮提取最常用的溶剂。然

而，在商业过程中通常只使用乙醇/水，因为它是安全和经济的。 Chiu等人已经报道了银杏内酯和黄酮类化合物的超临界流体萃取。尽管超临界二氧化碳具有安全性，但干燥的超临界流体不能提取萜内酯和黄酮类化合物，因此需要添加乙醇作为共溶剂。为了促进细胞中黄酮类化合物的快速提取，可通过采用一些物理或生物化学技术来破坏完整细胞。物理技术如超声波和微波辅助技术有助于从银杏叶或其他植物中提取黄酮类化合物，从而提高萃取率。也有几个研究小组研究植物黄酮类化合物的酶辅助提取法：Landbo和Meyer利用果胶酶和蛋白酶从黑醋栗果汁压榨残渣中提取花青素; Fu等人利用果胶酶，纤维素酶和beta;-葡萄糖苷酶从木豆叶中提取木犀草素和芹菜素;Chen等人利用斜卧青霉产生的纤维素酶提高银杏叶提取黄酮类化合物的产量。

已知大多数真菌能够降解木质纤维素，并且它们促进木质纤维素快速降解的能力已经引起科学家的广泛关注。木质纤维素的微生物生物降解不仅取决于微生物的类型，还取决于其生长条件。这种能力主要起源于其酶促系统的协同活性。因此，我们提出一种涉及真菌的预发酵处理方法来提高银杏黄酮类化合物的提取率。用于预发酵的真菌是从树龄古老的银杏树下的土壤中筛选出来，纯银杏叶用作促进黄酮类化合物释放的培养物。通过优化条件，银杏叶中总黄酮的提取量明显提高。用真菌来提高银杏黄酮提取率的新方法是可行的。据我们所知，本文是首次用发酵法提取银杏黄酮的报道。

材料及方法

银杏叶： 本研究中使用的银杏叶从邳州银杏研究所购买（中国江苏）。 干叶子研磨成粉末，随后通过840mu;m筛网筛分以控制粒度。

土壤样品： 土壤样品是2011年5月从安陆市附近的古银杏树地区采集。样品从腐烂的落叶层表面以下0-25厘米的深度取样，用木锤压碎， 通过2000mu;m筛网过筛，并转移到聚乙烯袋中。 将袋子密封并在4℃、相对湿度为65％的潮湿条件下储存，直至分析。

土壤样品的特性研究如下：通过M35红外水分分析仪（Sartorius，Germany）测定土壤样品的含水量，并且在105℃下干燥60分钟。通过在电马弗炉中在550℃下燃烧4小时来分析有机物含量，并且使用pH计（上海“SSS”试剂有限公司，中国）在1：1土壤/水中测量土壤样品的pH值。将真菌菌株分离与鉴定。把1克土壤样品分散悬浮在100mL无菌自来水中（在121℃高压灭菌30分钟），并以200rpm搅拌15分钟，以建立如Ulrich等人所述的稀释系列。悬浮液静置15分钟，将其从10-3连续稀释至10-6等份。把每一等份（0.5mL）收集并涂在含有Martin#39;s琼脂的11cm平板上，以计算好氧真菌的菌落形成单位（CFU）。重复进行多次。所有板在28℃下温育5天。并在10倍放大镜下，将单菌落的菌丝体进一步纯化以获得纯菌株。

我们试图通过使用18S rDNA测序鉴定这些菌株。真菌菌丝是从琼脂平板上采集。真菌菌丝并不能立即处理，而要在萃取之前先进行-80℃冷冻。将液氮加入到放有0.1g菌丝的1.5mL微量离心管中，并用杵将细胞精细研磨。利用Fungal DNA Kit（Omega，USA）公司提供的完整程序将真菌DNA分离和纯化。18S rDNA PCR扩大可通过使用Smit等人设计并由中国上海Generay生物技术有限公司合成的真菌特异性引物来实现，即EF4f（5#39;-GGA AGG G [G / A] T GTA TTT ATT AG-3#39;）和Fung5r（5#39;-GTA AAA GTC CTG GTT CCC-3#39;）。 50mu;L反应混合物含有1times;PCR缓冲液，5mM MgCl 2，2mM dNTPs，2.5U 来自 Fermentas 的Taq聚合酶，10mu;M引物（每个）和1mu;LDNA模板。将热循环仪加热至94℃3分钟;然后，在94℃下运行45秒，55℃运行45秒和72℃运行1.5分钟并重复35个周期;最后，在72℃下稳定7分钟。产品通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，同时由三工生物（上海）有限公司确定DNA序列。然后，此序列可使用NCBI Blast和RDP嵌合体检查项目进行分析。GenBank序列与克隆的序列最相似，连同它们的形态特征，都被用于真菌菌株的种属分类。

固态发酵预处理：使用SM-25螺旋混合器（日本Sanyo）以5：6的碎片/水质量比将干银杏叶和水混合20分钟。将混合物分装于多个250毫升三角烧瓶，每瓶含85克混合物，消耗约50％的瓶体积。这些瓶子用疏水性荧光膜（PTFE）膜密封（天科，上海嘉丰园艺日用品有限公司），并在115℃下灭菌15分钟，且原料中的黄酮醇没有显着损失（p lt;0.05）。

所有纯菌株的菌丝体在28℃培养5天;在BCM-100A无菌操作台（Airtech，苏州安泰空气技术有限公司，中国）上将0.03g菌丝体接种到250mL三角烧瓶中。实验一式三份进行。用PTFE膜密封后，倒置烧瓶10次以散布菌丝体。将这些烧瓶在26℃的培养箱的夹板上倾斜7天。制备用于分析黄酮类化合物和纤维素酶的固态发酵样品（SSFS）。使用相同培养过程的未接种培养物用作对照/非SSFS。

黄酮类化合物的提取70％（v / v）乙醇溶液作为提取黄酮类化合物的提取溶剂。十克SSFS或非SSFS置于250mL带盖的锥形瓶中，加入200mL溶液，并将样品浸入溶液中轻轻摇晃并在超声波设备（XO-5200DTNSN，南京中国中技股份有限公司，中国）中在一个功率为100 W、超声频率为25kMz、提取时间为45分钟和温度为60℃的优化超声波辅助程序下进行提取。过滤后，将滤液收集到干净的接收瓶中，并将滤饼依照上述提取过程再次处理。两次过滤的液体样品合并用于测定总黄酮含量（TF）。

TF的测定： Chang等人把紫外可见分光光度法用于确定总黄酮含量。半毫升的双倍稀释提取液（来自SSFS或非SSFS）或槲皮素标准溶液与3mL甲醇、0.2mL 10％氯化铝（用蒸馏水取代水用作空白溶液）、0.2mL的1M乙酸钾和5.6mL的蒸馏水相混合。保温60分钟后，用UV mini-1240分光光度计（日本岛津）测定真流水空白样在415nm处的吸光度。所有样品都测三次，粗黄酮平均含量表示为每克干重标样中有多少毫克槲皮素当量重量（dw），并根据标准校准曲线计算。

纤维素酶活性分析：滤纸分析方法是通过参照中国国家标准GB / T 23881-2009来确定总纤维素酶活性的方法。 5克SSFS或非SSFS用200mL柠檬酸盐缓冲液（0.05mol / L，pH5.5）提取。通过磁力混合器将悬浮液在室温下混合30分钟，然后在4℃保温24小时。过滤后，收集滤液用于分析。五十毫克定量纸（杭州新华纸业股份有限公司）在25mL试管中用1.0mL柠檬酸盐缓冲液浸泡，混合0.5mL的酶（0.04-0.18U / mL），并在37℃下保温60分钟。通过加入2.0毫升二硝基水杨酸（DNS）终止反应。控制管是与另外的2.0mL DNS一起保温。通过DNS方法估计还原糖的含量。单位活性定义为每分钟释放1mu;mol纤维二糖的酶的数量。纤维素酶的滤纸活性（FPA）是表示为每克干重SSFS每分钟释放的单位量。

黄酮类化合物的HPLC分析：在SSFS和非SSFS中的黄酮类化合物可通过通过HPLC方法分析;进行HPLC使用配备有Waters HPLC 2695系统（Waters，USA），这个系统包括Waters XBridge C18柱（5 mm，150 mmtimes;4.6 mm; Waters美国）和在370nm处的2489UV检测器。流动相A是1％磷酸溶液，流动相B为甲醇;柱温保持在40℃，流量设定为1.0毫升/分钟和注射量为5微升。 HPLC指纹图谱通过遵循线性梯度程序获得：在第9分钟流动相B浓度从5％上升到30％，在第21分钟上升到40%，在第40分钟上升到45%，在第45分钟上升到60%，在第51分钟上升到70%在第60分钟上升到90%，并最终保持20分钟。 HPLC指纹图被用于比较SSFS和nonSFFS中黄酮类化合物的组分。把从对照组中提取的黄酮类化合物的色谱峰设定为目标峰值。SSFS黄酮类化合物的色谱峰与目标峰是一一对应关系，并有着plusmn;3％的保留时间偏差。如果所有的峰都可以与目标峰一一对应，那么峰的相似性可以被认为是100％。

槲皮素、山奈酚和异鼠李素的标准品（上海杰瑞生物技术有限公司，中国）被用于分析SSFS的主要黄酮醇苷元。 由于山奈酚和异鼠李素的峰面积太小而无法计算，因此分析过程以10mu;L进样量和不同的洗脱程序进行，其中流动相保持恒定在流动相B的55％和流速为0.8毫升/分钟，洗脱30分钟。

Box-Behnken Design（BBD）和统计分析:响应曲面法（RSM）优化了Gyx086对SSFS总黄酮产量的预发酵条件。使用具有三个因子和三个水平的BBD（包括在中心点的三个重复）来拟合二阶响应表面。这些因素和水平是根据初步结果确定的。表2显示了本研究中调查的独立变量的实际范围和大小.BBD由SYSTAT 12（Systat Software，Inc.，Washington，USA）生成，并且该软件用于分析数据，描述响应表面，并生成响应曲面图。二阶多项式模型方程的拟合优度通过在5％显着性水平，决定系数R2和缺乏拟合性的F检验来表示。所产生的响应表面等高线图表明通过Gyx086增加SFFS中总黄酮产量的可能性。

用于TF和FPA的统计分析是由Windows 8.02的SAS系统（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）的单向ANOVA程序运行。选择Duncan的多范围测试作为程序中的比较方法，显着性水平设置为0.05。

结果及讨论

土壤表征和筛选菌株：破坏银杏叶完整细胞是改善黄酮提取的先决条件。植物细胞壁（主要由木质纤维素构成）的生物降解取决于微生物的降解能力。因此，真菌菌株的筛选是黄酮类化合物提取的关键因素。本研究中使用的菌株是从树龄老的银杏树下未开垦的土壤中分离出来的，树龄超过200年。这种土壤中真菌的存在归因于、于长期的自然选择和落叶银杏叶的存在。这些菌株被认为具有很强的适应性，并且可以导致银杏叶片的高效降解。古银杏树下土壤水分含量，有机质含量和pH值分别为18.53％，10.58％和5.4。这种具有高植物有机物质含量和酸值极端pH值的土壤适合真菌生长，特别是霉菌。根据“真菌菌株的分离和鉴定”所述方法，从土壤中获得107个纯的真菌分离株样品的形态特征，包括5个酵母菌株和102个霉菌菌株。经过反复形态观察，在50％甘油中最终只有76个菌株能在低温中储存。

这些分离物通过18S rDNA测序鉴定。它们被分为23个属：曲霉属（Aspergillus spp）（16株），青霉属（Penicillium spp）（19株），肉座菌属（Hypocrea spp）（5株），Bionectria spp（4株），枝孢菌属（Cladosporium spp）（3株），毛霉属（Mucor spp）（3株），Plectosphaerella spp（3株），Eupenicillium spp（3株），赤霉属（Gibberella spp）（2株），链格孢属（

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