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利用响应面法优化了四棱木茎中抗氧化多糖的超声提取工艺
摘要：采用响应曲面法（RSM）优化了四棱木（Trapaquadrispinosa）茎中抗氧化粗多糖（CPS）超声辅助提取（UAE）的实验条件。用1,10-菲咯啉的方法通过铁还原抗氧化能力（FRAC）测定测定多糖的抗氧化能力。在最佳提取条件下，提取时间41min，得到多糖的最大产量（2.78plusmn;0.16％）;水与物质的比例，31.5毫升/克;提取温度58◦C。最大抗氧化能力（19.020.24mu;molFe2 /g）的最佳提取条件下提取时间为38min;水与物质的比例为32mL/g;提取温度56◦C。这两个值与预测产量（2.75％）和抗氧化能力（18.77mu;molFe2 /g）一致。通过各种测定来研究CPS的抗氧化活性。结果表明，由UAE获得的CPS阿联酋显示1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH），2,2-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉）-6-磺酸（ABTS）自由基清除活性和还原力，总抗氧化能力与热水提取法（HWE）法得到的CPSHWE相当。结果表明，UAE是一种从四棱木茎中提取抗氧化多糖的可行方法，可探索多糖作为用于医药或功能性食品的潜在抗氧化剂。
plusmn;
关键词：TrapaquadrispinosaRoxb。抗氧化多糖超声辅助提取响应面法
1.介绍
多糖是植物中必不可少的重要生物大分子。多糖已被描述为具有多种治疗作用，包括抗炎，抗氧化，抗肿瘤，抗糖尿病和神经保护活性[1–5].大多数这些治疗效果主要归因于多糖的抗氧化活性。几种对DPPH和ABTS自由基，超氧阴离子和羟基自由基具有强清除活性的多糖已用于治疗癌症，糖尿病和阿尔茨海默病[6–8].通常，常规提取技术如热水或沸腾提取以及包括超声辅助提取（UAE），微波辅助提取（MAE）和加压水提取（PWE）的新颖提取方法，[9–12]是用于提取多糖。在这些技术中，阿联酋是一种替代传统提取方法的简单，快速，廉价且有效的方法。由于成本低，温度低，萃取产量最高，具有稳定的生物学特性，因此它是提取多糖的最有效的技术[13,14].一般来说，超声功率，提取温度，提取时间和液料比等多种参数影响多糖的提取，其影响可能是独立的或相互作用的。响应面法（RSM）已被描述为一种有效的统计技术，用于优化多糖提取过程，当自变量对所需响应具有组合效应时[15,16].此外，多糖的产量被认为是衡量提取过程的优点和缺点。然而，在这些提取过程中，由于提取时间长和提取温度高，多糖易因其降解和氧化而降低其抗氧化活性在水中加热提取[17–19].因此，开发简单，快速和准确的方法来测定多糖的抗氧化能力以评估提取过程是合乎需要的。然而，就我们所知，很少有报道描述了抗氧化剂方法用于评估提取过程。
T.quadrispinosaRoxb。又名四家岭，一种水生自由植物，由于其医疗功能和特殊的味道，是中国最受欢迎的蔬菜之一[20].T.quadrispinosa的果皮和茎通常被丢弃为废物。最近的研究已经报道，T.quadrispinosa的果皮表现出优异的抗氧化和抗癌活性，代表其优良的多酚含量[21,22].但是，据我们所知，T.quadrispinosa茎的组成和生物活性很少被检测到。
在我们的研究中，在T.quadrispinosa茎中检测到多糖，并表现出良好的抗氧化活性。因此，本研究的目的是探索超声波技术在从四棱木茎中提取粗多糖（CPS）和使用响应面法（RSM）优化提取条件方面的潜力。用1,10-菲咯啉简单准确的基于铁离子的总抗氧化能力方法研究CPS的抗氧化能力。采用Box-Behnken设计（BBD）对超声功率，提取时间，提取温度和液料比对CPS提取率和抗氧化能力的影响进行了优化。此外，通过体外各种测定法研究CPS的抗氧化性质。
2.材料和方法
2.1植物材料和化学试剂
从山东微山湖收集植物材料，经鉴定为四棱木茎。风干四棱叶粉末（约60目）用石油醚（60-90◦）脱脂，C）在索格利特装置中处理12小时，并用95％乙醇预处理小时以除去一些有色物质，单糖，寡糖和一些小分子物质[9].此后，通过过滤获得样品并在60◦℃下干燥直至达到恒重。D-葡萄糖，苯酚，七水合硫酸铁（FeSO4·7H2O），六水合氯化铁
·
2.2超声波辅助提取（阿联酋）
阿联酋在超声波装置（KQ-250DB，昆山超声波股份有限公司，中国）中进行，其频率为40kHz，功率为200W，并配备有温度控制器和数字定时器。样品（1.0g）在以下各种条件下用蒸馏水提取：120至200W的超声波功率，10至50分钟的超声时间，30至70◦的提取温度和20至100的液体与材料比率40毫升/克。提取后，将混合物以4000rpm离心10分钟以除去不溶物质。收集上清液并在60◦C下减压浓缩至一定体积，然后通过在4◦C下加入无水乙醇至最终浓度为80％（v/v）过夜而沉淀。通过以5000rpm离心沉淀15分钟获得粗多糖。将获得的粗多糖重新溶解于其中
表格1
用于Box-Behnken设计（BBD）的独立变量的编码和未编码级别。
|
独立变量 |
编码识别 |
||
|
-1 |
0 |
1 |
|
|
超声时间（X1）（min） |
30 |
40 |
50 |
|
液体与材料的比例（X2）（mL/g） |
25 |
30 |
35 |
|
提取温度（X3）（◦C） |
50 |
60 |
70 |
通过苯酚-硫酸法测定四歧蓟马茎的多糖产量百分比[23].选择葡萄糖作为标准，并且如下计算多糖产率（％）：
多糖产率（%）=（含量的粗多糖g/样品粉末重量g）*100%
根据1,10-菲咯啉的方法测定多糖的铁离子抗氧化能力[24]稍作修改。用0.2％的FeCl3溶液和0.5mL的0.5％1,10-菲咯啉溶液混合0.2mL各多糖溶液，然后用50％甲醇调节最终体积至10mL，混合充分地，在黑暗中保持30分钟并测量510nm处的吸光度。选择FeSO47H2O作为标准，并且多糖的抗氧化能力表示为每克重量材料的铁2 当量（mu;molFe2 /g）。
·
2.3实验设计
根据初步的单因子试验结果，利用RSM研究并优化了T。quadrispinosa茎的CPS条件。自变量优选超声时间（X1，min），液体与材料的比例（X2，mL/g）和超声温度（X3，◦C）。构建了三变量和三变量的BBD。由三份获得的多糖的产量和FRAC值被指定为响应依赖性值。变量及其级别，编码和实际值都在表中表格1。基于来自BBD的实验数据，进行回归分析，并且二阶多项式模型执行如下：
2.4CPS的抗氧化活性
通过DPPH自由基清除，ABTS自由基清除，还原能力和总抗氧化能力测定方法评价了两种CPS阿联酋和CPSHWE的抗氧化活性。
2.4.1DPPH自由基清除活性
如先前报道的那样测量CPS对清除DPPH自由基的活性[25]稍作修改。
将1.0mL的CPS水溶液（5-50mu;g/mLminus;1）彻底
与2.0mL新鲜制备的DPPH甲醇溶液（0.1mmolLminus;1）混合。然后将混合物在黑暗中在室温下温育30分钟。该溶液的吸光度是在517nm测量。清除活性用以下等式计算：
清除活性
A0为不含任何样品的DPPH溶液的吸光度，A1为样品与DPPH混合溶液的吸光度，A2为不含DPPH的样品溶液吸光度的吸光度。
2.4.2ABTS自由基清除活性
按照先前描述的方法进行CPS清除ABTS自由基的活性[26]与一些修改。将制备的ABTS 溶液在734nm处稀释至0.70plusmn;0.02的吸光度。将0.1mLCPS水溶液（5-50mu;g/mLminus;1）的等分试样与2.9mLABTS 溶液混合。在室温下反应6分钟后，立即在734nm处测量吸光度。根据方程式计算ABTS自由基清除活性。(3)用ABTS解决方案代替DPPH。
plusmn;
2.4.3降低功率测定
根据先前描述的方法通过Fe3 转化为Fe2 确定CPS的还原力[27]稍作修改。将等份的1.0mLCPS（50-400mu;g/mLminus;1）溶液与2.5mL磷酸盐缓冲液（pH6.6,0.2mol/Lminus;1）和2.5mL铁氰化钾（1％，w/v）。在50◦℃温育20分钟后，向混合物中加入2.5mL三氯乙酸（10％，w/v）并以4000rpm离心10分钟。最后，将2.5mL上清液与2.5mL蒸馏水和0.5mL氯化铁水溶液（1％，w/v）混合，测量吸光度在10分钟的反应时间之后在700nm下对空白。吸光度越高表示还原力越高。
2.4.4总抗氧化能力测定
用磷钼钼法评价CPS的总抗氧化能力[28].在典型的程序中，将1.0mLCPS（50-400mu;gmL-1）溶液与3.0mL试剂溶液（0.6M硫酸，28mM磷酸钠和4mM钼酸铵）混合。将混合物在90℃◦温育90分钟。冷却至室温后，在695nm处测量混合物对空白的吸光度。吸光度越高表明总抗氧化能力越高。
进行抗坏血酸作为阳性对照。所有的实验一式三份进行。
2.5傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析
通过分光光度计（Avater370，NicoletCo.，USA）测量来自四歧蓟马茎的CPS的FT-IR光谱分析。将约2mgCPS与100mg光谱级KBr粉末一起研磨，并压制成粒度为4000-400cmminus;1的FT-IR测量，分辨率为8cmminus;1[11].
2.6统计分析
设计专家版本8.0.5b（Stat-EaseInc.，Minneapolis，MN，USA）用于分析实验数据。方差分析（ANOVA）用于评估模型中的重要项。各种统计分析参数包括缺乏t检验，p值，F值，测定系数（R2），调整决定系数（RADJ2），变异系数（CV％）是评估模型充分性的首选。
3.结果与讨论
3.1单因素实验分析
本研究选取了超声功率，超声时间，料液比和萃取温度等四个影响阿联酋的关键参数进行调查。研究了超声波功率对CPS产率和FRAC值的影响，其他固相萃取条件如下：超声时间40min;液体与原料的比例为30mL/g;和提取温度，60◦C。如图所示图。1A，CPS的收率和FRAC值线性增加，在160W时达到最大值，在160W后，这两个值在提取过程中不再改变。因此，根据节能目的选择160W作为最佳超声波功率。超声时间对CPS产率和FRAC值的影响在10〜50min内进行了探索，其他提取方法如下：超声功率160W;液体与原料的比例为30mL/g;和提取温度，60◦C。超声时间对CPS产率和FRAC值的影响见表1图。1B.可以看出，当超声时间从10分钟增加到40分钟时，CPS的产率和FRAC值迅速增加，然后产率随着FRAC值的显着降低而下降。这些结果可以解释为提取时间增加导致材料细胞破裂的增加并且加速CPS向水中的释放和扩散。另一方面，过长的超声时间会导致CPS的氧化或降解;它会降低CPS的产量和FRAC值。因此，30-50分钟是合适的超声时间从四歧蓟马茎中提取CPS。固定超声波功率，160瓦;提取时间40分钟;和提取温度，60◦C;其中液体与材料的比例对CPS的提取率和FRAC值的影响如表1所示图。1CPS的产率和抗氧化能力随着液料比增加而迅速增加，从20〜35mL/
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