pH响应的自组装mPEG化肽类树状大分子-阿霉素纳米粒子在肿瘤治疗的应用外文翻译资料

 2022-08-07 15:21:06

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pH响应的自组装mPEG化肽类树状大分子-阿霉素纳米粒子在肿瘤治疗的应用

摘要

纳米颗粒，如树枝状聚合物，目前被认为是药物载体的最佳候选。在本研究中，我们报道了负载14.0 wt%（重量百分比）阿霉素（DOX）的mPEG化肽类树状大分子-阿霉素（dendroneDOX）结合载体的制备和表征。动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）研究表明，树枝状氧化锌自组装成具有中性带电表面的纳米颗粒。用扫描电镜和透射电镜观察了直径约80nm的球形和致密纳米颗粒。由于腙键的pH敏感性断裂，DOX在pH 5.0时的释放速率比pH 7.4时快得多。纳米颗粒在体外能有效地杀死癌细胞。重要的是，纳米颗粒在4T1乳腺肿瘤模型上具有较强的抗肿瘤活性和诱导凋亡作用。体内毒性评价表明，无药树状大分子和载药纳米颗粒对健康或荷瘤小鼠具有良好的生物安全性，因为组织学分析未发现明显的系统毒性。因此，功能化肽类树状酮偶联物纳米粒子可能是一种潜在的肿瘤治疗药物载体。

关键词：纳米颗粒 树枝状聚合物 自组装 药物输送 抗肿瘤 生物相容性。

  1. 引言

化疗已被大量研究用于治疗许多癌症。然而，这一领域最大的挑战之一是缺乏高效和安全的药物运载工具。纳米微粒作为纳米药物载体[1,2]，一种新兴的癌症治疗药物，由于具有通过增强的渗透和保留（EPR）效应和活跃的细胞摄取在肿瘤中更高的积聚等特性，在提高疗效的同时减少副作用[1,3]。在新兴的纳米技术平台中，脂质体和聚合物技术在可预见的未来可能具有巨大的潜在临床影响[4]。目前，天然高分子和合成高分子[5-7]，如树枝状高分子[8]，已经被广泛制备为纳米药物载体用于癌症治疗。

树枝状聚合物[9,10]，包括树枝状大分子和树枝状大分子[11,14]，由于其多功能性、精确的纳米结构、低多分散性、可控的分子大小、高度适应性的表面化学和化学稳定性的分子实体、具有极大的灵活性[13,15,16]，为药物载体的开发提供了一个潜在的替代途径，这些已经证明了许多可能的优势，例如药物靶向性和典型的胶体或大分子递送系统的药代动力学优势[16,17]。近年来，多肽树状大分子状聚合物由于具有与蛋白质相似的性质，如良好的生物相容性、水溶性和抗蛋白水解酶性等，成为药物传递系统的研究热点。然而，具有理想体内抗肿瘤特性的树状大分子药物结合物的开发还没有得到充分的解决，因为报道的树状大分子药物结合物尺寸小于10纳米，通过外渗或肾清除迅速从循环中清除[18]。

纳米颗粒，包括树状大分子/树状核药物递送系统，适合癌症治疗取决于其大小和表面性质[1,9,18-21]。对于树枝状大分子或树枝状大分子，可以通过增加生成和共价连接表面修饰两种方法来增加其分子量和大小，从而延长其血液循环，提高其抗肿瘤活性。然而，由于化学反应的空间位阻，制备更高一代的树状大分子并不容易[22]。同时，高世代树状大分子（超过5代）因其缓慢降解而引起副作用[22,23]。为了促进树状大分子的血液循环以及生物相容性，聚乙二醇（PEG）可以通过减少与内源性成分和巨噬细胞的非特异性相互作用来延长其在血液中的滞留时间，被用来修饰树状大分子的表面，形成一种新的树状结构。聚乙二醇树状大分子[24,25]作为药物传递[26-29]或成像探针[30]，通过增强的渗透和保留（EPR）效应，已经显示出药物负载和溶解度增加、血液循环延长和在肿瘤组织中的高蓄积[24]。此外，聚乙二醇化是避免网状内皮系统（RES）过早清除纳米颗粒的首选方法[5]。

另一个关于树状聚合物在特定应用中的发展的重要问题是它们自组装成纳米结构的能力[31-38]。经药物包封后，纳米结构具有作为药物载体的潜力。自组装可以克服与制备树状大分子相关的合成挑战[36]。在我们的研究组[39]和其他研究组[40]中，可降解的树状大分子/树状大分子被聚合到纳米载体上进行基因传递，证明树状大分子/树状大分子自组装比树状大分子或树状大分子更能增强DNA结合和将DNA导入细胞的效率。基于以上观察，我们提出的问题是，所制备的树状大分子多肽偶联物是否能聚合成纳米颗粒，是否适合作为具有良好生物安全性和显著抗肿瘤作用的纳米药物载体。然而，目前关于树状大分子肽纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究报道甚少。

在本研究中，我们描述了用于乳腺肿瘤治疗的pH刺激药物传递系统的mPEG化肽树状酮偶联物的制备和特性。对其生物安全性和抗肿瘤作用进行了评价。以mPEG为载体，通过点击反应，在液相条件下采用发散策略合成了高收率的树状大分子保护尾；DOX作为一种广泛应用的抗肿瘤化疗药物，通过pH敏感的腙键与树状大分子保护尾结合，如图1所示，通过树状酮自身控制的自组装形成致密的纳米壁。研究了纳米颗粒作为pH刺激药物传递系统的大小、形态、zeta电位、药物释放、抗肿瘤作用和毒性等体内外特性，结果表明，肽类树状纳米颗粒有望作为乳腺癌治疗的药物传递载体。

  1. 材料和方法

2.1.材料和测量

N、N-二异丙基乙胺（DIPEA）、1-羟基苯并三唑（HOBt）、N，N，N，N四甲基（1H-苯并三唑-1-基）六氟磷酸尿苷（HBTU）、丙炔胺、三氟乙酸（TFA）和甲氧基聚乙二醇（mPEG，2 Ka）从SigmaeAldrich购买，未经进一步纯化使用。Boc-L-Lys（Cbz）-OH，H-L-Glu（OBzl）-OBzl·TsOH和Boc-L-Lys（Boc）-OH购自GL Biochem（Shanghai）Ltd.根据文献合成了叠氮甲氧基聚乙二醇（mPEGeN3）[41,42]，4-（N-叔丁氧基羰基肼基）-4-氧基丁酸[43]和叔丁基肼酸[44]。

用1hnmr、电喷雾电离飞行时间质谱（ESI-TOF-MS、Waters-Q-TOF-Premier）和基质辅助激光解吸电离时间质谱（MALDI-TOF、Autoflex-MALDI-TOF/TOF）对树枝状中间体和产物进行了表征和结构确认。采用饱和a-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）（水：乙腈0.1%TFA，50:50）为基质溶液制备样品进行MALDI分析，用400兆赫Bruker高级光谱仪在室温下获得1hnmr数据，并在d标度上以ppm表示化学位移。采用紫外分光光度法（PerkineElmer）测定多肽树状大分子结合物DOX的含量。释放的DOX由荧光检测器（F700，日立，日本）检测。

在JEM-100CX（JEOL）透射电子显微镜下，用磷钨酸在碳包铜网格上对样品进行了染色，观察了颗粒的形貌。使用Zetasizer Nano-ZS（英国伍斯特郡Malvern仪器公司）在毫微克水中进行了DLS和zeta电位测量。所有100 mg/mL的样品均在20℃、 将纳米颗粒溶液直接滴入硅片上制备样品，并在室温下干燥过夜，用于扫描电镜（S-4800，日本日立）研究。用倒置荧光显微镜（Leica DMI4000B）观察处理后的组织切片。

2.2.mPEG化肽类树状阿霉素偶联物的制备

H-L-Glu（OBzl）-OBzl·TsOH（1.20 g，2.40 mmol）在氮气下溶解于无水DMF（30 mL）中。加入DIPEA（1.86 g，14.4 mmol）。溶液在0℃搅拌10分钟，BoceL-Lys（Boc）eOH（1.0 g，2.88 mmol），HOBt（0.39 g，2.88 mmol）和HBTU（1.09 g，以固体混合物的形式同时加入2.88 mmol），在氮气中于冰浴中搅拌30 min，在室温下搅拌24 h。通过旋转蒸发去除溶剂，并通过柱层析（硅胶，CH2Cl2:MeOH，20:1）纯化混合物，在高真空下干燥过夜，以77.1%的产率(1.21 g,1.84 mmol)生成树状大分子1。1H NMR (400 MHz, DMSO), delta;= 1.04-1.58 (m, 24H, CH2-Lys 和CH3-Boc), 1.87-2.04 (d,2H,COCH(R)CH2CH2),2.44(t,2H,CH(R)NHCH2CH2CO),2.84(s,2H, CH(R)NHCH2CH2CH2CH2NH), 3.84 (s, 1H, CH(R)NHCH2CH2CH2CH2NH), 4.36 (s,1H, COCH(R)NHCH2CH2CO), 5.01-5.15 (d, 4H, C6H5CH2O), 6.70-6.88 (d, 2H, NHBoc),7.10-7.48 (br, 10H, C6H5CH2O), 8.24 (s, 1H, CONH).

将树状大分子1（0.5 g，0.76 mmol）溶于无水二氯甲烷（DCM）/TFA（1:1，10 mL）。将溶液在氮气下搅拌30分钟，通过旋转蒸发除去溶剂，然后在高真空下干燥样品1小时，加入无水乙醚并出现沉淀。用离心法收集沉淀，用无水乙醚洗涤3次。样品在高真空下干燥1h，溶解于20 mL无水DMF中，然后加入DIPEA（0.59 g，4.5 mmol）。将Boc-L-Lys（Boc）-OH（0.64 g，1.83 mmol）、HOBt（0.25 g，1.83 mmol）和HBTU（0.70 g，1.83 mmol）作为固体混合物同时加入，并在氮气下将溶液在冰浴中搅拌30分钟，在室温下搅拌24小时。通过旋转蒸发去除溶剂，并通过柱层析（硅胶，CH2Cl2:MeOH，20:1）纯化混合物，在高真空下干燥过夜，以80.6%的产率（0.68g，0.61mmol）生成产物树状大分子2。1H NMR (400 MHz, DMSO),delta;= 1.11-1.63 (m, 54H,CH2-Lys 和 CH3-Boc), 1.81-2.13 (m, 2H, COCH(R)CH2), 2.43 (m, 2H, CH(R)CH2CH2CO), 2.71-3.03 (m, 6H, CH(R)NHCH2CH2CH2CH2NH), 3.84 (m, 2H,

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