刺激响应的Janus肽树突-药物偶联物作为一种安全的纳米级药物传递载体用于乳腺癌治疗外文翻译资料

 2022-08-08 09:47:42

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刺激响应的Janus肽树突-药物偶联物作为一种安全的纳米级药物传递载体用于乳腺癌治疗

李宁，郭春，段镇宇，于灵竹，罗奎，路觉，顾忠伟

摘要：智能纳米级给药系统已经被研究作为给药载体的潜在候选。在这里，我们使用乳腺癌模型来确定酶反应的Janus dendron (mpeg - ylated dendron - pvglg - dox)结合基纳米系统是否将是一种有效和安全的化疗药物传递载体。为此，我们通过方便快捷的液相合成，制备了脯氨酸-缬氨酸-甘氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸(Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly, PVGLIG)寡肽的基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)/ mmp -9敏感链。其次，采用合理的设计策略，通过铜催化的两步高效炔叠氮化物点击环加成(CuAAC)反应，成功地将Janus dendron (Boc-G2L-G3L-OMe)修饰为mPEG和pvglg - dox。通过动态光散射、扫描电子显微镜和原子力显微镜等形态学研究，证实了Janus mPEGylated dendron - pvglg - dox缀合物自组装成表面略带负电荷的紧凑纳米粒子。采用紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱和基质辅助激光解吸/电离飞行时间分析了含有4.0 wt%(重量百分比)阿霉素(DOX)的纳米颗粒的纳米体系。用外源性MMP-2杀死的乳腺癌细胞培养的纳米系统比没有MMP-2的系统更有效。与free DOX相比，纳米级系统大大减少了副作用，并具有相似的抗肿瘤功效。此外，它具有最小的全身毒性，特别是dox对荷瘤小鼠和健康小鼠的正常器官的毒性，这可以通过体重变化和组织学分析来确定。这些数据表明，以Janus dendron药物结合物为基础的纳米级系统可能是一种有效的乳腺癌化疗运载工具。

关键词：纳米给药 药物载体 基因载体 细胞毒性

一. 介绍

化疗是癌症治疗中最有希望的治疗方法之一。然而，在维持其抗肿瘤功效的同时，仍需采取相应的策略来提高其生物安全性。阿霉素(DOX)是治疗乳腺癌、卵巢癌、肉瘤、儿童实体瘤等癌症最有效的化疗药物之一。不幸的是，它的应用受到其心脏毒性的严重限制，包括可能导致双心室衰竭甚至死亡的心肌病的发展[1]。来克服这些挑战,考虑的特殊微环境肿瘤与正常组织相比,纳米技术开发提供一个创新的靶向型药物替代策略,通过提高渗透率和保留(EPR)的影响[2-4],和纳米粒子设计来提高治疗效果,减少副作用[5 - 8]。在已报道的纳米粒子中，聚合物纳米给药系统在可预见的未来具有巨大的潜在临床影响。肽树枝状大分子、树枝状大分子和它们的树枝状聚合物是由具有明确的树状分支结构的氨基酸组成的大分子。它们具有结构明确、分支结构高、功能端基密度高、水溶性好、生物相容性好等优点，是很有前途的药物传递载体。然而，低一代的树枝状大分子或基于树枝状大分子的载体均小于10nm，不足以满足EPR标准。此外，尽管高世代树枝状大分子在尺寸上略大，但细胞毒性增加。由于它们的缓慢退化被观察到。peg修饰是通过与聚乙二醇共价结合修饰生物分子来解决这一问题，peg修饰的树突聚合物显著延长了血液循环时间[10,11]。在我们之前的研究中，我们用低分子量PEG (MW= 2000)修饰了低代树突状分子，得到的聚乙二醇化树突状聚合物具有良好的生物相容性[12,13]。通过聚乙二醇化和共轭化学制备的两亲性树枝状聚合物-药物缀合物自组装成纳米级给药系统，由于这些给药系统智能且对刺激反应灵敏，从而提高了治疗指标并降低了副作用。在智能纳米药物输送系统,不仅是高药物积累中观察到肿瘤通过EPR效应,但药物控制释放也展示了特殊的微环境的肿瘤,具有独特的属性,如酸性pH值,独特的酶和低氧浓度[14 - 20]。我们之前的工作表明，酶敏感的药物递送系统有潜力作为高效的药物递送载体，四肽甘氨酸- pheu - leu -甘氨酸(GFLG)被用作将抗癌药物偶联到树枝状支架上的连接剂。这些给药系统对组织蛋白酶B敏感，组织蛋白酶B是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在许多肿瘤细胞和肿瘤内皮细胞中过表达。它们的聚合物-药物偶联物在转运过程中在血浆和血清中表现出稳定性，并在胞吞作用后允许溶酶体内的药物释放。

尽管有报道称聚乙二醇有助于在循环过程中稳定纳米颗粒，但高表面密度的聚乙二醇会阻碍细胞摄取并降低药物释放速率。除了细胞内enzyme-sensitive药物输送系统,extracellularsensitive系统,如那些基质金属蛋白酶(MMP)响应[23-26]，have也被设计为潜在的药物输送系统,和运营商和药物释放的细胞外分解可以提高药物吸收细胞和渗透。因此，我们有兴趣设计一种对细胞外环境敏感，并能避免PEG干扰的药物传递系统。MMP-2——MMP-9-sensitive药物输送系统已经设计并准备使用一个寡肽proline-valine——glycine-leucine-isoleucine-glycine (Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly PVGLIG)间隔附加药物聚合物,因为它们[27,28]与肿瘤有关的酶,属于一个家庭的蛋白酶降解细胞外基质(ECM)成分[29-31]。之前，PVGLIG连接剂是通过固相合成制备的，不适合大规模生产。基于以上的观察，我们推断一个稳健和灵活的综合策略可以发展;因此，以PVGLIG为连接剂，制备了一种两亲性、聚乙二醇化、mmp敏感的树枝状聚合物-药物缀合物。合成的偶联物具有较强的抗肿瘤作用，副作用低。本研究设计并制备了一种mmp敏感给药载体(Janus mpeg化肽dendron - pvglg - dox偶联物)，并对其在乳腺癌治疗中的给药能力进行研究。制备该共轭物的合成路线如图1和图1所示。点击反应是利用PVGLIG作为敏感连接剂将DOX连接到mpeg化的肽树突上。通过动态光散射(DLS)、扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(ATM)的研究，发现该共轭物具有理想的尺寸、zeta电位和形貌。评价其体外抗癌效果。研究了偶联给药系统的体内抗癌效果，并通过一系列在正常小鼠体内的实验评价了其生物安全性。

二. 实验

2.1材料与方法

N, N-Diisopropylethylamine (DIPEA) 5-hexynoic酸,1-hydroxybenzotriazole (HOBt)、N, N, N0, N0-tetramethyl - (1 h-benzotriazol-1yl) uronium方法(HBTU) 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT), 2 - (7-aza-1H-benzotriazole-1-yl) 1, 1, 3, 3-tetramethyluronium方法(HATU),三氟乙酸(组织),甲氧基聚(乙二醇)(mPEG 2 kDa)、抗坏血酸钠, 4-叠氮苯甲酸和2-噻唑烷硫酮购自Sigma-Aldrich(美国)，未经进一步纯化使用。噻唑烷-2-硫酮(TT)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、4-氨基苯基醋酸汞(APMA)和MMP-2(小鼠，重组，rmMMP-2)购自Sigma-Aldrich公司。合成了peg - g2l - g3l -炔烃。在PEG修饰之前的肽基树突的分子量显示在ESIdagger;(图S1-S6)。

采用电喷雾电离质谱(ESI MS, TSQ量子超LC-MS/MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF, Autoflex MALDI-TOF/TOF)质谱对树枝状中间体和产物进行了表征和结构鉴定。一般是10毫克毫升?12日5-dihydroxybenzoic酸(DHB)(水/乙腈= 2/1,0.1%的组织)和125毫升的柠檬酸diammoniumhydrogen蒸馏溶液(18毫克每毫升)或375毫升乙醇溶液2 5 dihydroxyacetophenon (DHAP)(20.2毫克每毫升)和作为一个矩阵谱技术分析样品制备的解决方案。在室温下使用400 MHz的布鲁克高级光谱仪获得1H NMR数据，在d标度上以ppm记录化学位移。使用Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments，伍斯特郡，英国)在MilliQ水中进行DLS和zeta电位测量。

2.2酶反应性聚合物-药物缀合物的合成

N3-Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly-OMe的综合。在ESI中给出了Boc-Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly-OMe的合成过程。dagger;在氮气气氛下，Boc - pro - val - gly - leu - Ile-Gly-OMe (6.1 g, 9 mmol)产物上的Boc基团如“synthesis of Boc - leu - Ile-Gly-OMe”(见ESIdagger;)所述被脱保护，形成白色固体。在氮气气氛下，白色固体，4-叠氮苯甲酸(1.2 g, 10 m mo l)， H B T U(4。1 g, 1 1 m m o l)， a n d H o B T(1。5 g, 1 1 m m o)溶于无水DMF (400 ml)。DIPEA (7 ml, 45 mmol)加入冰浴中。冰浴搅拌30 min，室温搅拌48 h，反应结束后除溶剂，加入乙酸乙酯(600 ml)， NaHCO3aq洗涤有机溶液。(satd.)， HCl (1 M)， NaCl aq，干燥，旋转蒸发浓缩至40ml。以乙酸乙酯和乙醚为原料，经重结晶得到棕褐色固体(5.5 g, 7.7 mmol，收率85%)。[(m H) ， C34H52N9O8 ]， C34H51N9O8Na 。N3-Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly-TT的综合。首先将N3-Pro - val - gly - leu - il - gly - ome (2 g, 2.8 mmol)产物溶解于甲醇(350 mL)和NaOH aq (1 M, 100 ml)中，然后在4 1C下搅拌24 h。反应结束后，去除甲醇，将溶液加入600 ml的乙酸乙酯中。用0.5 M HCl aq调pH至2-3，然后用NaCl aq (satd.)洗涤三次，然后除去溶剂。棕色的固体被收集起来并称量以供进一步使用。在氮气气氛下，将噻唑烷-2-硫酮(0.4 g, 3.6 mmol)和DMAP (1.3 g, 11 mmol)溶解在200 ml无水DCM中。然后，将N3-Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly-OH (1.3 g, 1.8 mmol)溶解于无水DMF溶液中加入冰浴。搅拌30分钟后,无水DCM解决EDC(5毫升,0.7克,3.6更易)添加一滴一滴地到这个解决方案,其次是搅拌4 1 c 48 h。反应后,DCM(400毫升)补充道,和有机溶液与HCl (aq)洗。(1米)和生理盐水aq,那么解决方案是干和溶剂被旋转蒸发去除。残渣在4 1C下从乙醚-聚酯醚混合物中重结晶，得到淡黄色固体(630 mg，产率43.7%)。ESI-MS: m/z 824.25 [(m Na) ， C36H52N10O7S2Na ]。mpeg化树枝状聚合物-药物缀合物的合成。

N3-Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly-TT (630 mg, 0.8 mmol)和DOX?将HCl (580 mg, 1 mmol)溶解到15 ml无水DMF中，然后加入15 ml蒸馏过的吡啶。图1为mpeg化树枝状聚合物-药物缀合物的制备及其自组装到纳米级药物传递系统(纳米级系统)的演示图。

在氮气气氛下，peg - g2l - g3l -炔烃(540 mg, 50 mm

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