基于罗丹明染料的F127-三聚氰胺-甲醛聚合物纳米粒子的比率纳米温度计：制备、表征、宽范围的温度传感和精确的细胞内温度测量外文翻译资料

 2022-08-25 21:37:14

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基于罗丹明染料的F127-三聚氰胺-甲醛聚合物纳米粒子的比率纳米温度计：制备、表征、宽范围的温度传感和精确的细胞内温度测量

吴友申，刘家骏，马景文，刘永春，王亚，吴道成

西安交通大学生命科学与技术学院教育部生物医学信息工程重点实验室

西安大学，710049，中华人民共和国

摘要：使用掺有罗丹明染料的聚醚F-127-三聚氰胺-甲醛复合聚合物纳米颗粒（R-F127-MF NPs）制备一系列荧光纳米温度计（FTs）。高度可溶的罗丹明染料分子与聚醚F127胶束结合，随后在高温交联处理过程中掺入交联的MF树脂纳米粒子中。利用动态光散射，电子显微镜和傅里叶变换红外（FTIR）对R-F127-MF 纳米粒子的形貌和化学结构进行了表征。然后使用荧光光谱分析荧光性质和热响应性。发现R-F127-MF纳米粒子是单分散的，尺寸范围为88-105 nm，并且在严格的处理如高压灭菌和冻干中具有明亮的荧光和高稳定性。通过在纳米粒子中以1：400的掺杂比例同时掺入罗丹明B和罗丹明110（作为参考）染料，使比率FTs具有7.6％·℃-1的高灵敏度和-20至110℃的宽温度感应范围。 FT在具有不同pH，离子强度和粘度的溶液中表现出良好的稳定性，并且在细胞内和细胞外环境中具有相似的工作曲线。使用FT成功监测Hela细胞在微波暴露期间的细胞温度变化，表明它们在生物医学领域具有相当大的潜在应用价值。

关键词：细胞内温度计，比率式温度计，罗丹明染料，宽范围温度传感，三聚氰胺-甲醛树脂

1 介绍

作为一种常见且重要的物理量，温度在各种科学领域中起着关键作用，微尺度和纳米尺度的温度测量在工业、纳米技术和生物医学科学领域具有重要意义。而某些材料的发光特性与温度有关，通过分析材料的发射，可以获得周围温度，从而为温度传感提供快速，无创的方法。

最近，已经开发了许多用于纳米级测温应用的FTs。各种荧光纳米粒子（NP）材料，例如纳米金刚石，半导体量子点（QDs），荧光金纳米簇，镧系元素纳米粒子和热响应纳米凝胶，已经用于FTs，并且这些材料中的一些已成功应用于特定的纳米级测温应用,包括细胞内温度传感。在关节中，纳米级测温应用需要具有宽感应范围的荧光温度传感器。具有更高分辨率（灵敏度）和更好热稳定性的FT在微流体系统、生物技术和空气动力学的研究中具有重要意义。例如，以罗丹明B染料为分子温度传感器，可获得微流体通道中电动泵送缓冲液引起的焦耳热的热成像；发现T形微流体系统的温度变化范围可能大于40℃。聚合酶链的DNA扩增过程反应（PCR）广泛应用于分子生物学；在PCR的热循环过程中，溶液温度应在从室温到94-96℃的宽范围内精确控制。 然而，报告的FTs的温度感测范围仍受所用材料的热稳定性的限制。例如，绿色荧光蛋白（GFP）的温度感应范围是20-50℃；纳米凝胶FTs的感应范围在凝胶的转变温度附近约为plusmn;15℃；Albers等人开发了具有QDs的比率FT，其温度范围为20至40℃；李等人开发了FT，其中硅纳米粒子的感应范围为0-60℃。尽管用无机荧光材料（例如镧系元素NPs）制备的一些FTs可以在更宽的温度范围（50-300K）内起作用，但是需要紫外（UV）激发。紫外线可能会导致生物样本的强烈背景，从而限制了这些材料的生物医学领域的应用，因为常见的共聚焦显微镜和流式细胞仪通常配备有更长波长（405,488和533nm）的激发激光。特别地，某些FT的传感特性可能在复杂的传感环境（溶液，细胞和组织）中发生变化，并且在严重的处理过程中会恶化，例如121℃的高压灭菌和储存。因此，迫切需要具有稳定精度、宽感应范围、良好生物相容性以及适当激发和发射的FTs。 上述最近的研究集中在荧光纳米颗粒（NP）材料及其制造上。事实上，几种有机荧光团，如罗丹明染料，具有热响应性，可用于测温应用。

此外，罗丹明B与参考荧光团一起使用以获得比率变化的排放。通过将罗丹明B与荧光共轭聚合物结合，叶等人制备了比率式FT，其已成功用于Hela细胞的细胞内温度感测。然而，罗丹明B和聚合物之间的共价键导致温度传感灵敏度显着降低；因此，强度比仅为10-60℃温度范围内变化的2.2倍。由于罗丹明B在水中的高溶解度（15 g·L-1），通过沉淀或浸泡制备的含罗丹明B的荧光纳米颗粒的稳定性不能轻易满足测温应用的要求，并且染料会在储存和使用过程中从荧光颗粒中泄漏。因此，为了制备明亮的比率FTs，仍然缺乏适当的制备方法将罗丹明B和参比染料有效地用于生物医学领域中的宽温度范围内。

方案1 R-F127-MF-NP FTS的制备及其细胞内温度测定的示意图

三聚氰胺-甲醛（MF）树脂是一种透明（用于紫外-可见光）聚合物，具有高度交联的内部结构和良好的热稳定性，被认为是荧光材料制备的优异基质。在以往的研究中，我们开发了一种有机溶胶 - 凝胶法制备单分散MF颗粒，并研究了荧光增强MF微球的可溶性染料掺入和颗粒形成机理。在该方法中，首先通过三聚氰胺和多聚甲醛在溶液中的聚合制备可溶性MF预聚物，并将支化结构的预聚物分子混合与可溶性染料缀合。通过高温交联处理，MF预聚物分子进一步聚合成微球，结果可溶性染料如罗丹明B可以定量包封在MF微球中。然而，该方法只能制造所报道的微粒化荧光颗粒。尽管可以通过添加表面活性剂来制备MF NPs，但添加的表面活性剂如十二烷基硫酸钠也会阻碍染料和预聚物之间的结合相互作用，因此妨碍了荧光MF NPs的制备。然而，尚未报道出制备罗丹明B MF NP的合适方法。值得注意的是，嵌段共聚物聚醚F-127可以用作制备间苯二酚鈭鈭甲醛（RF，MF的类似树脂）NPs的表面活性剂。聚醚F-127和罗丹明染料也可在水中形成均匀的染料-胶束包合物，并可在溶胶-凝胶过程中进一步用二氧化硅涂覆。考虑到MF NPs的溶胶-凝胶颗粒形成机理，该染料-胶束内含物也可以掺入形成的MF NPs中。受此发现的启发，我们开发了一种三步法制备含罗丹明染料的聚醚F127-MF复合NPs（R-F127-MF NPs），如方案1所示。

罗丹明染料最初与F127胶束结合。将得到的染料-胶束内容物与三聚氰胺和多聚甲醛进一步聚合，制备染料-胶束-MF聚合物络合物。在酸催化下，该配合物在100℃的高温下交联，导致形成单分散的荧光NPs。值得注意的是，聚醚F127不仅可以在这三步法中帮助形成MF NPs，还可以与罗丹明染料结合形成染料-胶束包合物，然后形成染料-胶束-MF聚合物复合物。因此，罗丹明染料可以牢固地结合在制备好的NPs中。通过在NP中同时加入传感器染料（罗丹明B）和参比染料（罗丹明110），比率式FTs制备了与温度相关的变化发射特征，可在-20至150℃的宽温度范围内起作用而不会发生聚集或染料泄漏。这些FT对各种环境因素，包括pH、离子强度和粘度，具有良好的稳定性，并且可以经受严格的处理，例如高压灭菌和低温保存。更重要的是，制备的FTs具有更高的灵敏度和良好的生物相容性，可用于细胞内温度测量。FTs还在细胞内和细胞外环境中表现出类似的工作曲线，表明可以精确测量与疾病相关的细胞的绝对温度，且已经成功地测量了在不同功率下微波暴露期间的蜂窝温度变化。使用共聚焦显微镜系统实时监测该微波加热过程，从而提供在宽温度范围内的生物应用的可行性。

2 材料和方法

2.1 材料

聚醚F-127 (F127)， 罗丹明B (RB)，罗丹明110 (R110)，二甲基亚砜(DMSO)和3-(4,5-)分别为-2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT)采购自美国圣路易斯。三聚氰胺、多聚甲醛、甘油、盐酸溶液(1.0mol·L-1)购自阿拉丁化学(上海)有限公司。所有试剂均为分析级，未经进一步纯化使用。所有实验均采用去离子水。

2.2 R-F127-MF NPs的制备

掺入浓度为1.0mu;mol·g-1的F127-MF NPs（R-F127-MF NPs）的罗丹明染料如下制备（使用RB染料作为实例）。将1克聚醚F127和2.0毫克RB染料与100毫升水混合并搅拌2小时以形成染料-胶束包合物，接着加入1.3g三聚氰胺和1.9g多聚甲醛，并将混合物在50℃下加热并磁力搅拌70分钟以形成染料-胶束-聚合物复合物，然后使用三层滤纸过滤所获得的染料-胶束-聚合物复合物溶液以除去不溶性杂质。然后将该溶液与1-3mol·L-1的盐酸溶液以1：5的体积比混合，并在100℃（在沸水浴中）加热40分钟与NPs形成交联。将制备的掺入RB的F127-MF NP用CENTRICON（德国达姆施塔特）离心过滤器（30 000 NMWL）对其进行5次水洗并分离，然后将获得的NP冻干并保持在4℃。在相同的工艺条件下，制备具有不同掺杂浓度的RB NP和R110染料掺入的F127-MF NP（R110-F127-MF NP）。为了制备同时含有参考染料和传感染料的NPs (R110-RB-F127- mf NPs NPs)，首先用F127制备R110和RB染料作为染料-胶束包体，然后将两种染料-胶束包体溶液按一定比例混合，制备染料-胶束-聚合物复合物，通过高温交联，制备了双染料共混的染料-胶束-聚合物络合物NPs，通过改变两种染料胶束包合溶液的混合比例，可以调整这两种排放的比例。

2.3 鉴定

采用JEOL(日本东京)JEM-2100

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